SPAG9 在结直肠腺瘤及结直肠癌中的表达及意义

陈灿坚 尹朝晖

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，在中国则占据常见恶性肿瘤的第3～4 位，其发病率和病死率均有逐年上升的趋势[1]。由于目前对结直肠癌的病因和发病机制尚未完全明了，早期诊断和预后检测也不够完善，因此研究结直肠癌的早期肿瘤标志物以及探寻以分子生物学为靶点的治疗途径成为热点，这些研究将有助于对结直肠癌的早期临床诊断、指导治疗和评价预后；并且为进一步探讨结直肠癌的发病机制提供依据。

精子相关抗原9(Sperm-associated antigen 9，SPAG 9)是癌睾丸抗原（Cancer-testis antigen，CTA)家族的新成员，在睾丸组织中特异性表达；近年来研究发现其与多种恶性肿瘤相关，如肾癌[2]、宫颈癌[3]、子宫内膜癌[4]、甲状腺癌[5]等。SPAG9 作为支架蛋白与c-jun N端激酶(c-jun NH 2-terminal kinase，JNK)相互作用，通过调节与之相关的MAPK组件的信号强度发挥作用[6-8]，从而调控人体多种生理功能，并与某些疾病和肿瘤的发生发展相关；而且JNK已被证实可以促进多种肿瘤细胞的生长[9-10]，推测肿瘤组织高表达SPAG9 蛋白可通过改变MAPK信号通路的强度，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移。目前有关此基因在结直肠肿瘤中表达情况的报道尚少，因此本文采用免疫组化法对结直肠腺瘤、结直肠癌和结直肠正常组织SPAG9 蛋白的表达进行检测，以探讨其在结直肠癌发生发展中的作用及临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取2011 年9 月-2013 年2 月汕头大学医学院第一附属医院普通外科手术切除（或结肠镜下息肉切除）且经病理诊断的结直肠组织69 例，结直肠腺瘤18 例，临床资料完整，其中男48 例，女39 例；年龄30～86 岁，平均年龄60 岁。结直肠癌病理分级(按WHO标准)：I 级12 例，II 级29 例，Ⅲ级21 例，IV 级7 例，腺瘤18 例；全部病例术前均未行放、化疗。对照组为汕头大学医学院法医学教研室切取的意外死亡者正常结肠组织标本20 例，所有标本均由本院病理科医师复核分级。

1.2 主要试剂 兔抗人SPAG9 多克隆抗体购（Abcam公司，美国），即用型快捷免疫组化MaxVision试剂盒（鼠/兔）和DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组化采用即用型快捷免疫组化MaxVision法。所有组织均经多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片4 μm厚，脱蜡和水化后，3%过氧化氢溶液处理，PBS冲洗3 次，3 min/次；在EDTA抗原修复液（PH 8.0）中进行抗原修复8 min；每张切片加1 滴3%过氧化氢，室温下孵育10 min，PBS冲洗3 次，3 min/次；除去PBS液，每张切片加1 滴1∶200 稀释的一抗(兔抗人SPAG9多克隆抗体)，4℃过夜；PBS冲洗3 次，3 min/次；除去PBS液，每张切片加1 滴即用型快捷免疫组化MaxVision试剂，室温下孵育20 min，BS冲洗3 次，3 min/次；除去PBS液，每张切片加2 滴新鲜配制的DAB，显微镜下观察3～5 min；自来水冲洗，苏木素复染，PBS冲洗返蓝，DAB显色，脱水、透明、封片。阳性对照为睾丸组织，PBS代替一抗作阴性对照，其他步骤与待测标本相同。

1.3.2 判断标准免疫组化结果采用半定量积分法分析，每例切片选5 个高倍视野，观察细胞着色百分率和细胞质的着色程度，取其均值，按阳性细胞数占同视野计数细胞的百分比，≤5%为0 分；5%～25%为1 分；25%～50%为2 分；50%～75%为3 分；75%为4 分。阳性强度以多数细胞呈色为准，未着色为0 分，淡黄色为1 分，橙褐色为2 分，棕褐色为3 分。两者相乘0 分为(-)，1～3 分为(+)，4～5 分为(++)，≥6 分为(+++)。

1.4 统计学方法 所有数据采用SPSS 17.0 统计软件进行处理，组间SPAG9 阳性率用χ2检验，方差分析检验水准α=0.05，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

SPAG9 在20 例正常结直肠及69 例癌旁组织中均不表达，而在腺瘤及结直肠癌标本中高表达，腺瘤表达阳性率77.8%（14/18），结直肠癌表达阳性率为81.2%（56/69)；SPAG9 在腺瘤与结直肠癌的表达无统计学意义。SPAG9 蛋白表达主要位于肿瘤细胞膜及胞浆，呈淡黄色或棕褐色，肿瘤间质未见明显表达（见图1)。SPAG9 的表达与结直肠癌患者年龄、性别、血清CEA水平、淋巴结转移、组织分级均无明显的相关关系，而与临床分期有统计学意义，在早期结直肠癌为I+II(92.7%)、进展期结直肠癌为III+IV(64.3%)，P＜0.05。表1 示，SPAG9 在腺瘤表达阳性率77.8%（14/18），结直肠癌表达阳性率为81.2%（56/69)。

图1 免疫组化检测ASPAG9 蛋白在结直肠腺瘤、结直肠癌（按临床期别）的表达情况（×200）

表1 SPAG9 表达与结直肠癌临床指标的关系

3 讨论

癌睾丸抗原CTA是一类具有特异性表达模式的肿瘤相关抗原，主要表达于睾丸的生殖细胞、卵子及胎盘的滋养层细胞，近年来研究发现其在多种肿瘤组织中有不同程度的表达。Zendman等[11]认为其可能参与细胞信号通路传导、基因转录及翻译、染色体重排。在恶性肿瘤组织中，该类抗原的表达与肿瘤细胞的无限增殖、迁移、侵袭能力及远处转移有关[12]。

SPAG9 蛋白是CTA家族的一员，SPAG9 编码的蛋白与JNK相互作用蛋白（JNK interacting protein，JIP）具有结果同源性，且氨基端有JNK结合位点，被认为是JIP家族的一员。研究证实，SPAG9 在促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路中作为一种支架蛋白与JNK相互作用，通过调节与之相关的MAPKs组件的信号强度发挥作用[5]，参与人体多种生理作用的调控，并且在细胞生长、增殖、凋亡和肿瘤发展中有重要作用。Kanojia[13]在结肠癌细胞株（COLO 205、HCT 116）和结肠癌组织中检测到SPAG9 mRNA和蛋白表达，且70.4%结肠癌患者血清中出现了SPAG9 的特异性抗体，推测其可能通过MAPK信号通路在结肠癌的发生发展中发挥作用。

本实验发现SPAG9 在结直肠腺瘤及结直肠癌标本中高表达，在正常结直肠及癌旁组织中均不表达；在早期结直肠癌表达为I+Ⅱ(92.7%)、进展期结直肠癌为Ⅲ+Ⅳ(64.3%)，P＜0.05。笔者的数据显示，SPAG9 表达水平在临床期别的差异有统计学意义。由于癌细胞的侵袭性取决于肿瘤不断迁徙与侵袭特性，Kanojia[10]通过SPAG 9 SiRNA转染后减少了SPAG9 蛋白表达，致结肠癌细胞的迁移和侵袭能力显著下降和改变，减少SPAG9 蛋白在体内的表达可以明显延缓肿瘤的生长，从而证实了SPAG9 在大肠癌的发生发展中的潜在作用。本实验进一步证实SPAG9 在肿瘤的临床早期阶段（Ⅰ和Ⅱ期）表达的密切关系，表明SPAG9 可能在细胞生长、增殖、细胞迁移、浸润中扮演一个重要的作用。

其他学者在研究SPAG9 与肿瘤的生物学行为同样发现，运用RNA干扰技术于体外下调宫颈癌[3]、甲状腺癌[10]、肾细胞癌[2]等细胞的SPAG9 表达，发现这些细胞生长受抑制，细胞迁移和侵袭能力下降，其中甲状腺癌、肾癌细胞的克隆形成能力也下降；此外，用裸鼠进行移植瘤体内实验，发现SPAG9 基因干扰后，结肠癌、宫颈癌的肿瘤细胞生长受到明显抑制[3，10]。虽然上述实验结果提示SPAG9 与肿瘤的生物学行为密切相关，但其机制尚不清楚。氨基酸序列分析揭示了SPAG9 蛋白包含JBD，研究发现，若将SPAG9 的可读框第111～934 bp区域突变，使其缺乏JBD，它就不能参与JNK通路而发挥作用，这表明SPAG9 是通过JBD与JNK相互作用[14]。JNK家族是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族成员之一，属于进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[15]，JNK信号转导通路是MAPK通路的一个重要分支，在细胞周期、分化、凋亡、应激等多种生理和病理过程中起重要作用。近年来在JNK信号通路中发现多种潜在的支架蛋白，如JNK连接蛋白JIP、JNK相关亮氨酸拉链蛋白JLP等[16]，这些支架蛋白与JNK及MAPK信号通路中的其他成员相结合形成复合物，从而对信号通路的效率及特异性起重要调节作用[15]。研究证实，SPAG9 在MAPK信号通路中可能是作为一种支架蛋白通过与JNK的相互作用，参与人体多种生理功能的调控，并与某些疾病和肿瘤的发生发展相关[17]。然而，作为JIP家族的新成员，SPAG9 蛋白如何精细调节这些信号通路及为何在结直肠癌早期表达还有待进一步研究。

目前，在许多肿瘤组织中都可检测到SPAG9 蛋白，该蛋白在乳腺癌[5]、宫颈癌[3]、甲状腺癌[5]和肺癌[18]组织中的表达率分别为88%（88/100）、82%（54/66）、78%（108/138）和77.78%（21/27）。研究者发现90%（18/20）的上皮卵巢癌组织[19]中也有SPAG9 蛋白表达，且早期上皮性卵巢癌SPAG9 mRNA的表达率较高。本研究同样验证了SPAG9 蛋白的高表达与CRC发展的早期和晚期阶段有显著密切的关系（P＜0.003）。由于SPAG9 的潜在作用，作为一种新型的生物标志物，有利于癌症的早期检测和诊断。

研究已经证实SPAG9 蛋白在许多肿瘤患者中如卵巢癌[19]、肾癌[2]、乳腺癌[5]、宫颈癌[3]可以激发机体体液免疫反应，并在患者血清中检测到特异性抗体，而针对肿瘤免疫原的抗体进入血液循环早于抗原，且抗体的量远远大于抗原，所以检测血清中的特异性抗体相对血清抗原而言是具有其独特的优势，尤其是在肿瘤的早期，更易被检测，所以SPAG9 蛋白及其血清抗体是更有前景和应用价值的肿瘤组织学和血清学标志物。

近年来，针对SPAG9 蛋白的肿瘤疫苗也备受学者关注，本实验证实SPAG9 在结直肠腺瘤及结直肠癌组织中高表达，且与临床早期密切相关，可以作为结直肠癌的早期检测和诊断，阻断SPAG9 表达可能为结直肠癌的靶向治疗提供新的选择。

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