蛋鸭卵黄HI试验不同样品制备方法的比较

周 寅

(宁波市江北区畜牧兽医站，浙江宁波315021)

免疫抗体检测是防控高致病性禽流感的重要手段，蛋鸭在产蛋期间对采血反应敏感，易造成养殖户的经济损失。因此，采用卵黄替代血清有着重要的临床意义。

研究表明，卵黄通过制备进行HI 试验可以检测禽流感疫苗免疫抗体水平，且制备方法有多种。本研究试用氯仿、PBST、PBS、生理盐水等4 种不同试剂制备卵黄样品，在相同条件下进行禽流感HI 试验，并与对应血清进行比对，从而确立一种适用于基层，准确、简单，便于大样本操作的制备方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

禽流感H5 Re-6 亚型抗原和标准阳性血清:由哈尔滨某生物技术开发公司生产，批号为20130218。

供试用卵黄及血清:从宁波市江北区某种鸭场选取个体差异不显著的产蛋鸭20 羽，180日龄，经H5N1 禽流感疫苗三次免疫，单羽笼养，收集鸭蛋40枚;同时采集对应鸭的静脉血，分离血清，对应编号。

试剂:1%鸡红细胞悬液;氯仿(分析纯)，购自宁波化学仪器厂;PBST(pH 7.2)、PBS(pH 7.2)、生理盐水(0.9%)，实验室配制。

其他用品:96 孔V 型微量板，无菌采血器、烧杯、微量振荡器、5 mL U 形管，定量移液器。

1.2 试验方法

1.2.1 不同制备方法卵黄HI 抗体效价比较

氯仿萃取法:1 mL 卵黄加入1 mL 生理盐水，充分混合后加入2 mL 氯仿，充分振荡，静置1 h，然后1500 r/min 离心10 min，取上清液备用。

PBST 直接稀释法:1 mL 卵黄加入1 mL PBST，充分振荡混匀后备用。

PBS、生理盐水处理法:同PBST。

将同一编号经四种不同方式处理的卵黄样品和对应血清，在相同条件下参照《GB/T 18936－2003高致病性禽流感诊断技术》规定的血清HI 方法进行检测，观察样品性状和非特异性凝集情况，并对实验结果进行统计分析。

1.2.2 重复性试验 抽取编号不同的三组样品，在相同条件下重复3 次，观察可重复性。

1.2.3 冻融前后不同方法制备的卵黄抗体效价比较 抽取编号不同的三组样品，－20℃冷冻保存，2 d 后取出解冻，在相同条件下进行HI 方法检测，冻融两次，比较冻融前后抗体效价的差异性。

2 结果与分析

2.1 不同方法制备的卵黄样品及对应血清的HI 试

验结果 详见表1。

表1 不同方法制备的卵黄样品及对应血清的HI 试验结果

由表1可见，经氯仿、PBST、PBS、生理盐水制备的样品结果与血清HI 抗体效价都很接近，经t 检验4 种方法制备的卵黄样品抗体效价与血清抗体效价差异均不显著(t ＜t0.05，P ＞0.05)。由此可见，4 种制备方法均能使卵黄很好地替代血清检测禽流感疫苗的免疫抗体水平。

2.2 不同方法制备的卵黄样品性状及非特异性凝集情况 详见表2。

表2 不同方法制备的卵黄样品及血清HI 试验

经氯仿萃取法制备的卵黄样品澄清透明，结果判定最为容易;PBST、PBS、生理盐水直接稀释法制备的样品较为浑浊，但不影响结果判定。

由表2可见，氯仿萃取法制备样品出现的非特异性凝集数量较少，与血清接近;PBS 与生理盐水直接稀释的样品出现非特异性凝集较多。

2.3 重复性试验 详见表3。

表3 重复性试验结果

由表3可见，采用不同方法制备的卵黄样品平行试验的抗体效价差异均在一个滴度以内，重复性良好。

2.4 冻融前后不同方法制备的卵黄样品及对应血清抗体效价的变化比较 详见表4。由表4可见，经氯仿萃取法制备的卵黄样品冻融前后抗体效价稳定，与血清基本一致。PBST、PBS、生理盐水经直接稀释法制备的卵黄样品冻融一次后检测结果比冻融前的抗体效价高出2 个滴度以上，经t 检验差异极显著(t ＞t0.01，P ＜0.01)，二次冻融后效价与一次冻融效价保持基本一致。

表4 冻融前后不同方法制备的卵黄样品及对应血清HI 试验结果

3 小结与讨论

3.1 通过4 种不同方法制备的卵黄样品均能替代血清检测禽流感疫苗的免疫抗体水平，其中氯仿萃取法是4 种方法中最为稳定可靠，能溶解卵黄中的脂肪，将卵黄抗体提纯，样品澄清透明，与血清性状相似，能很好替代血清检测。但其方法繁琐、费时，且有毒性。PBST、PBS、生理盐水直接稀释法只是将卵黄稀释，杂质较多，非特异性凝集偶有发生。冻融后效价波动较大，样品只能常温或4℃保存，保质期较短。但优点在于操作简便，尤其是生理盐水无论是自行配制或购买成品，都十分方便，适合大样本、大批量的检测工作。

3.2 在试验操作中，直接稀释法制备的样品有时会出现非特异性凝集，可能与两方面因素有关:一是简单稀释后样品溶液中脂类等杂质较多;二是鸭蛋卵黄与体红细胞存在非特异反应。如何减少直接稀释法的非特异性凝集需进一步研究探讨。在HI 试验结果判定时要以沿斜面向下呈线状流动作为完全不凝集的标准，若有时正面难以判断，可从反面观察判断。

3.3 直接稀释法制备的卵黄样品在冻融后抗体效价会高于冻融前抗体效价，且用吐温作为保护剂效果不很明显。发生这种现象的原因尚不清楚，估计可能因卵黄免疫蛋白多以脂蛋白形式存在，冻融影响组织结构，使蛋白与脂类分子间位置关系发生改变之故。

综上所述，氯仿萃取法适用于小样本检测，精确度较高。如果用于基层兽医实验室日常免疫抗体检测，样本数量较大，且只需观察效价整齐度和阳性率者，则以生理盐水直接稀释法较为适宜，但对出现非特异性凝集而影响群体免疫水平评估的样品应当用氯仿萃取法重新制备检测。