氟化物添食对家蚕耐氟品种和敏感品种5龄幼虫体内蛋白质及谷胱甘肽硫转移酶含量的影响

李冬兵 赵 凯 刘 学锋 王 一 曾 泽彬

(宜宾市农业科学院食用菌蚕桑研究所，四川宜宾 6 44600)

氟化物添食对家蚕耐氟品种和敏感品种5龄幼虫体内蛋白质及谷胱甘肽硫转移酶含量的影响

李冬兵 赵 凯 刘 学锋 王 一 曾 泽彬

(宜宾市农业科学院食用菌蚕桑研究所，四川宜宾 6 44600)

为探明家蚕耐氟化物机理，以家蚕耐氟品种T6和敏感品种734为材料，通过人工添食NaF的方法测定了其血液与中肠组织蛋白质及谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)的活力。结果表明:随着NaF添食浓度的增加，敏感品种734血液蛋白质浓度低于耐氟品种T6血液蛋白质浓度，而两者中肠组织的蛋白质浓度无明显差异。敏感品种734血液及中肠组织的GSTs酶活力呈现幅度较大的波动;耐氟品种T6血液中的GSTs酶活力呈现上升趋势，中肠组织的GSTs酶活力波动的幅度较小。由此可见，耐氟家蚕品种能够在氟化物的调控下提高体内GSTs的含量，推测其为耐氟家蚕品种具有氟化物抗性的原因之一。

家蚕;氟化物;耐氟品种;敏感品种;谷胱甘肽硫转移酶;抗性

氟化物是一类原生质毒剂，其广泛存在于自然界中。氟化物对家蚕具有较强的毒害作用，可与家蚕细胞、组织及器官相互作用，引发一系列生物物理或生物化学反应，导致效应器官生理机能下降，最终导致家蚕死亡。当前，我国工业飞速发展，大气氟污染也随之日益严重，蚕区家蚕氟化物中毒事件时有发生，对蚕业生产造成了巨大的经济损失。因此，选育耐氟化物家蚕品种显得尤为重要。

谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)是一类多基因家族编码的解毒酶，其主要功能是催化某些内源性或外来有害物质的亲电基团与还原型谷胱甘肽的巯基结合，形成更易溶解的、没有毒性的衍生物，使其易于排出体外或者被相关代谢酶类分解［1－3］。由此可见，生物体遇到逆境时，GSTs可发挥脱毒与抗氧化的功能［4］。因此，GSTs与昆虫代谢抗性具有一定的相关性，即昆虫体内解毒酶的解毒能力增强是产生抗性的原因之一［5］。

本研究以家蚕耐氟品种和敏感品种为材料，通过人工添食NaF得到不同中毒程度的家蚕幼虫，测定2种家蚕品种体内血液与中肠组织中蛋白质及GSTs酶活力的差别，找出氟化物对家蚕蛋白质及GSTs的影响，为探明家蚕耐氟机理及氟化物对鳞翅目昆虫的毒害机理提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试家蚕品种:耐氟品种T6、敏感品种734，均由西南大学生物技术学院家蚕生物育种实验室提供。

主要试剂:考马斯亮蓝G－250(Coomassie brilliant blue G－250)为上海化学试剂公司产品，谷胱甘肽－S转移酶测定试剂盒为南京建成生物工程有限公司产品。考马斯亮蓝G－250的配制:称取10 mg考马斯亮蓝G－250，溶于5 mL 95%的乙醇中，加入85%(v/v)的磷酸10 mL，最后用蒸馏水定容到100 mL，置于4℃的冰箱中保存;pH=7的磷酸缓冲液的配制:按磷酸氢二钠∶磷酸二氢钠=61∶39的体积比配成。1 mg/mL牛血清白蛋白标准液的配制:准确称取10 mg牛血清白蛋白，溶于10 mL的蒸馏水中。

主要试验仪器:酶标仪，由BIO－RAD公司生产;T6新世纪紫外可见光分光光度计，由北京普析通用有限责任公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计及样品制备 供试耐氟品种T6、敏感品种734的家蚕，4龄前按普通饲育条件饲养［6］，5龄起蚕时数蚕分区，每个蚕品种各分为4区，每区400头蚕，试验区分别使用涂了0(对照)、50、100、200 mg/kg NaF溶液的桑叶饲育，每天喂3次，以添食24 h后为梯度，一直添食至第7天;分别于5龄第1天至第6天，从各处理组中随机选取10头家蚕，取血液和中肠制备酶液，于－80℃超低温冰箱中保存备用。

1.2.2 家蚕血液和中肠组织蛋白质含量的测定参照参考文献［7］的方法制作蛋白质含量标准曲线;利用考马斯亮蓝G－250法，测定样品的蛋白质含量［7］。分别取PBS稀释10倍的血液和中肠组织的酶液0.02 mL，加入1 mL考马亮蓝G250，25℃水浴2 min，在酸标仪中595下测OD值，根据标准曲线求出家蚕体内血液和中肠组织蛋白质含量(μgpro·insect)。

图1 蛋白质含量标准曲线

1.2.3 家蚕血液GSTs酶活力的测定 参照南京建成生物工程有限公司生产的谷胱甘肽硫转移酶试剂盒说明书。将基质液、家蚕血液于测定管中混匀后37℃水浴30 min，然后加入试剂2与家蚕血液，离心后进行显色反应。

单位定义:规定每毫升血清在37℃反应1 min，扣除非酶促反应，使反应体系中谷胱甘肽(GSH)浓度降低1 umol/L为1个酶活力单位。

1.2.4 家蚕中肠组织GSTs酶活力的测定 试验方法同 1.2.3。

单位定义:规定每毫克中肠组织蛋白，在37℃反应1 min，扣除非酶促反应，使反应体系中GSH浓度降低1μmol/L为1个酶活力单位。

2 结果与分析

2.1 家蚕血液中蛋白质含量的变化

由试验结果(表 1)可知，当 NaF的浓度为50 mg/kg时，敏感品种734与耐氟品种T6家蚕血液中蛋白质的含量无明显差异;当浓度高于50 mg/kg时，耐氟品种T6家蚕血液中蛋白质的含量高于敏感品种734家蚕血液中蛋白质的含量，这可能与其均有较高的耐氟化物特性有关。

表1 添食不同浓度NaF对不同品种5龄家蚕血液蛋白质含量的影响

2.2 家蚕中肠组织蛋白质含量的变化

敏感品种734与耐氟品种T6各处理区与对照区的家蚕中肠组织蛋白质的含量无明显差异;随着添氟天数的增加，中肠组织蛋白质的含量出现上下波动，但波动的幅度较小，表明氟化物对家蚕中肠组织蛋白质的含量没有明显影响(表2)。

表2 添食不同浓度NaF对不同品种5龄家蚕中肠组织蛋白质含量的影响

2.3 家蚕血液中GSTs酶活力的变化

2.3.1 敏感品种734家蚕血液中GSTs酶活力的变化 敏 感品种734的5龄家蚕添食NaF后血液中GSTs酶活力变化如图2所示。当NaF的浓度为50 mg/kg时，血液GSTs酶活力接近对照组，且变化趋势相近;添氟浓度高于50 mg/kg时，与对照组相比GSTs酶活力出现上下波动，变化趋势差异较明显，表明家蚕正常生理活动出现紊乱，出现氟中毒的迹象。到5龄第6天时，随着添氟浓度的增加血液中GSTs酶活力逐渐地减少。

图2 添食NaF对敏感品种734家蚕血液GSTs酶活力的影响

2.3.2 耐氟品种T6家蚕血液中GSTs酶活力的变化 耐氟品种T6的5龄家蚕添食NaF后血液中GSTs酶活力变化规律较为明显，添氟组的血液中GSTs酶活力值基本高于对照组，且随着添氟浓度的增大，其GSTs酶活力值随之变大(图3);由此可知，氟化物可诱导耐氟品种T6血液中GSTs的合成。到5龄第6天，试验区与对照区GSTs酶活力差别不大。比较图2与图3可以看出，随着饲养天数的增加，在相同添氟浓度下，T6的5龄家蚕血液中GSTs酶活力随着氟浓度增高而成上升趋势，而敏感品种734则出现上下波动;耐氟品种T6的血液中的GSTs酶活力大于敏感品种734。

图3 添食NaF对耐氟品种T6家蚕血液GSTs酶活力的影响

2.4 家蚕中肠组织GSTs酶活力情况

2.4.1 敏感品种734家蚕中肠组织GSTs酶活力情况 敏感品种734的5龄家蚕添食NaF后家蚕中肠组织GSTs酶活力变化如图4所示。当NaF的浓度为50 mg/kg时，随着添氟天数的增加，家蚕中肠组织GSTs酶活力值接近对照组;当添氟浓度大于50 mg/kg时，随着添氟天数的增加，家蚕中肠组织GSTs酶活力值出现较大的波动。这表明添氟浓度为50 mg/kg时，敏感品种734正常的生理活动开始受到影响，随着添氟天数的增加，影响变大。

图4 添食NaF对敏感品种734家蚕中肠组织GSTs酶活力的影响

2.4.2 耐氟品种T6家蚕中肠组织GSTs酶活力情况 耐氟品种T6的5龄家蚕添食NaF后中肠组织GSTs酶活力变化如图5所示。当添氟浓度为200 mg/kg时，随着添食天数的增加，耐氟品种T6家蚕中肠组织GSTs酶活力均低于对照组，GSTs酶活力呈现下降的趋势;当添氟浓度低于200 mg/kg时，添氟组家蚕中肠组织GSTs酶活力接近或高于对照组，说明添氟浓度为200 mg/kg时，耐氟品种T6家蚕的正常生理活动受到影响。到5龄第6天时，随着添氟浓度的增加中肠组织GSTs酶活力逐渐减少。对比图4和图5可知，随着5龄家蚕添氟天数的增加，耐氟品种T6各添氟组家蚕中肠组织GSTs酶活力波动的幅度较小，而敏感品种734各添氟组中肠组织GSTs酶活力波动的幅度较大。

图5 添食NaF对耐氟品种T6家蚕中肠组织GSTs酶活力的影响

3 讨论

耐氟品种T6与敏感品种734血液与中肠组织蛋白质的含量，随着添氟天数和浓度的增加，都未见明显的变化，因此推测氟化物对家蚕体内蛋白质的含量影响较小;但耐氟品种T6家蚕的血液中GSTs酶活力的变化有一定的规律性，随着添氟天数和浓度的增加，其血液中的GSTs酶活力也相应增加，而其中肠组织GSTs酶活力波动的幅度较小，表明氟化物对蚕血液的毒害作用比中肠低。

敏感品种734各添氟组蚕的血液及中肠组织GSTs酶活力变化无明显规律，随着添氟天数和浓度的增加，其GSTs酶活力值出现较大幅度的波动，但最终呈下降趋势。这表明氟对敏感品种734中肠及血液的毒害均较大。有研究结果表明，对天然的有毒物质、工业污染及化学农药具有抗性的昆虫，体内的GSTs酶含量通常都比无抗性的昆虫高［8］，说明昆虫体内GSTs活性的升高是产生抗性的重要原因之一。因此，推测家蚕对氟化物的抗性可能与体内GSTs酶活力的高低有关。

从耐氟品种T6中肠组织的GSTs酶活力变化可以看出，在一定范围内，氟化物能够促进家蚕体内GSTs酶含量的增加。由于GSTs基因的转录产物为GSTs酶，由此推测，一定浓度范围内的氟化物，可能会引起GSTs酶相关基因表达的上调［9］。如果这一推测成立，就意味着GSTs基因以表达量的增加维持体内GSTs酶的正常水平及功能，从而形成抗性。这一推测还需要进一步的试验验证。

耐氟品种T6的氟化物抗性较高但经济性状较差，敏感品种734具有良好的经济性状却不耐氟;因此，如将T6的氟化物抗性基因导入敏感品种734中，使734成为具有良好经济性状的抗氟化物蚕品种是今后的研究方向。

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S881.2

A

1007－0982(2014)02－0008－05

2013－12－19;

2014－01－13

现代农业产业技术体系建设专项(编号CARS－22)。

李冬兵(1988—)，男，云南曲靖，本科，助理农艺师。

Tel:0831－6256573，E-mail:ldbing123@126.com

刘学锋(1963—)，男，四川宜宾，本科，高级农艺师。

Tel:0831－6256573，E-mail:yibinshiyongjun@163.com