对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒检测及各基因型分析

张 娜 刘 骁 庄广儒

（湛江出入境检验检疫局 广东湛江 524000）

1 前言

传染性皮下和造血器官坏死病是由传染性皮下和造血器官坏死病毒（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）引起。IHHNV是目前已知最小的对虾病毒，病毒粒子大小为20nm-22nm，是无囊膜的二十面体，线性单链DNA，估计长度为4.1 kb，在CsCl中的浓度为1.40 g/mL，核衣壳蛋白至少由4个分子量分别为74 kD、47 kD、39 kD、37.5 kD 的多肽组成[1]。

IHHNV可感染大部分对虾，并且感染后可造成极高的死亡率或严重影响生长，使其畸形[2-3]，目前没有有效的疫苗，也没有有效的治疗药物。世界动物卫生组织（OIE）将此病划为须申报的甲壳类重要疾病之一，我国农业部把其列为动物二类动物疫病。近年来随着对虾种苗和水产品国际贸易交流增多，种苗及亲虾的大量引进增加了疫病在我国传播的机会。

OIE的研究指出IHHNV至少有3个不同的基因型[4]，一是分离自美洲和东亚（主要是菲律宾），二是分离自东南亚，三是分离自马达加斯加、印度、毛里求斯和澳大利亚（定为3A型）和分离自东非、莫桑比克和坦桑尼亚（定为3B型）。其中前两个基因型为感染型IHHNV病毒株，而3A型和3B型为非感染型IHHNV病毒株，且现有OIE资料把3A型和3B型两个基因型定义为假定IHHNV型（putative IHHNV），认为这些假定IHHNV型是插入斑节对虾基因组中的一段序列，并不感染南美白对虾[5]。对IHHNV进行分型时，2012年版OIE《水生动物疾病诊断手册》推荐了309F/R和MG831R/F两对引物，前者只与感染型IHHNV毒株（Ⅰ型和Ⅱ型）结合，后者与非感染型IHHNV病毒株结合。

为了更好地了解目前IHHNV的各种基因型，本研究根据IHHNV不同基因型的特异性引物，对一例进境南美白对虾亲虾进行IHHNV病毒分型检测，并对IHHNV各基因型序列进行同源性比对，为IHHNV各基因型序列分析提供更多的数据。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验材料

湛江地区某对虾养殖场随机采取进境南美白对虾亲虾3尾。

2.1.2 试剂

rTaq 反应酶、dNTP、DNA 分子量标准物DL2000、琼脂糖：均为大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司产品。

2.1.3 仪器设备

PCR扩增仪：德国Biometra公司；凝胶成像仪：德国Biometra公司；5417R高速冷冻离心机：Eppendorf公司；电泳仪：DYY-8C，北京市六一仪器厂。

2.2 方法

2.2.1 样品中病毒DNA抽提

将3尾活体虾的鳃组织作为样品，使用QIAGEN的DNA提取试剂盒提取DNA。

2.2.2 PCR引物合成

根据OIE推荐的的引物序列，由大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司合成。其中，389F/R：上游引物5’-CGG-AAC-ACA-ACC-CGACTT-TA-3’，下游引物5’-GGC-CAA-GACCAA-AAT-ACG-AA-3’；77012F/77353R：上游引物5’-ATC-GGT-GCA-CTA-CTC-GGA-3’，下游引物5’-TCG-TAC-TGG-CTG-TTCATC-3’；392F/R：上游引物5’-GGG-CGAACC-AGAATC-ACT-TA-3’，下游引物5’-ATCCGG-AGG-AAT-CTGATG-TG-3’；309F/R：上游引物5’-TCC-AAC-ACT-TAG-TCA-AAACCA-A-3’，下游引物5’-TGT-CTG-CTA-CG A-TGA-TTA-TCC-A-3’；MG831F/R：上游引物5’-TTG-GGG-ATG-CAG-CAA-TAT-CT-3’，下游引物5’-GTC-CAT-CCA-CTG-ATC-GGACT-3’。

2.2.3 PCR扩增初筛

用引物389F/R、392F/R、77012F/77353R进行PCR扩增，反应体系为25μL：10×PCR buffer 2.5μL，10×Mg2+（0.2mM) 2.5μL，上下游引物（40μmoL/L）各1.5μL，dNTP(各2.5mM)5μL，Taq酶0.5μL，模板5μL，然后加水至总体积到25μL。将反应管至于PCR仪中，反应程序如下：94℃ 4min预变性；94℃1min，55℃ 1min，72℃ 1min，32次循环；72℃10min，4℃ 保存。PCR扩增物进行琼脂糖凝胶电泳观察结果。

2.2.4 IHHNV病毒分型

引物309F/R和引物MG831F/R分别对样品DNA进行PCR扩增，反应体系和反应程序如2.2.3。

2.2.4 扩增产物测序与序列同源性比对

PCR扩增条带由上海英骏生物技术有限公司测序，测序结果分别与NCBI中IHHNV基因序列比对。同时用DNAstar软件对309F/R引物扩增出来的序列与IHHNV福建分离株、夏威夷分离株、马达加斯加分离株、坦桑尼亚分离株、泰国分离株进行序列比对。

3 结果与讨论

3.1 PCR扩增初筛结果

以南美白对虾亲虾鳃组织DNA为模板，389F/R 引物扩增，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示一条大小约为389bp的特异性目的条带，与预计大小一致 （见图1）。

图1 PCR产物电泳分析-389bp片断

3.2 用特异性引物进行IHHNV基因分型结果

Tang[6]指出引物77012F、77353R扩增的是IHHNV非结构蛋白和结构蛋白之间的一段区域，引物392F/R和389F/R扩增的是IHHNV ORF 1的一段序列，这两对引物分别从IHHNV基因和假定IHHNV型扩增出来的目的片断同源性达100%，所以引物392F/R和389F/R是IHHNV进行初筛的首选引物。选用309F/R引物进行基因分型是因为IHHNV基因组和IHHNV假定IHHNV型的基因组中ORF1的碱基变化（分别为8%和14%）高于ORF 2的碱基变化（分别为5%和9%），3A型和3B型的基因与309F/R引物不结合。

本研究以南美白对虾亲虾鳃组织DNA为模板，用引物77012F和77353R、引物392F/R、引物MG831F/R和引物309F/R进行PCR扩增，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示特异性目的条带与预计大小一致，分别为356bp、392 bp、无条带、309 bp （见图2）。引物309F/R扩增出与预计大小一致的条带，而引物MG831F/R在相应位置没有条带，初步认定所检的南美白对虾亲虾不是非感染型毒株（3A型和3B型）。

图2 PCR产物电泳分析-392bp、309bp片断

3.3 扩增片段同源性比对结果

将309F/R引物PCR扩增产物的测序结果与NCBI中IHHNV基因序列比对，同源性达98%以上；同时采用DNAstar软件将此测序结果与IHHNV福建分离株、夏威夷分离株、马达加斯加分离株、坦桑尼亚分离株、泰国分离株基因序列比对，同源性分别为99%、98.7%、79.9%、90.6%和93.9%（见图3），显示分离的309bp序列与IHHNV非感染型毒株3A型（马达加斯加分离株）和3B型（坦桑尼亚分离株）的同源性较低，而与感染型毒株（夏威夷分离株）同源性较高（>95%），进一步证明样品检测出的是IHHNV感染型毒株。

图3 样品扩增序列309bp同源性比对结果

4 结论

本研究使用5对引物对样品进行PCR检测，用引物MG831F/R和引物309F/R进行样品病毒分型，结果显示引物309F/R扩增出的309片断，通过与IHHNV各基因型序列进行同源性比对分析，证明样品为IHHNV 感染型毒株，这为今后进一步的检测工作奠定了基础。

［1］Bonami J R.Purification and characterisation of the infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus of Penaeid shrimps[J].General Virology,1990,71:2657-2664.

［2］Bray W A.The effect of salinity on growth and survival of Penaeus vannamei,with observations on the interaction of IHHN virus and salinity[J].Aquaculture,1994,122:133-146.

［3］Browdy C L.IHHN virus and intensive culture of Penaeus vannamei:effects of stocking density and water exchange rates[J].Crust Biol,1993,13:87-94.

［4］OIE.水生动物疾病诊断手册[M].北京：中国农业出版社，2012.

［5］Tang K F J,Poulos B T.Geographic variations among infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) isolates and characteristics of their infection[J].Diseases of Aquatic Organisms,2003,53:91-99.

［6］Tang K F J,Lightner D V.Detection and quantitation of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp by real-time PCR[J].Diseases of Aquatic Organisms,2001,49:79-85.