全蝎纯化液对凝血酶诱导血管内皮细胞LDH 活性、ET－1表达的影响1）

周牡娜，谭 茜，郑洁钢，邹 茜，黄 莺，彭延古

血管内皮细胞不仅是血液与血管内皮细胞之间重要的生理屏障，而且是高度活跃代谢库，能分泌作用不同的活性物质，以维持血管收缩和舒张、抗凝与促凝平衡［1］。随着对血管内皮功能进一步的深入研究表明，内皮细胞功能障碍是导致多种心血管疾病发病的始动或促进因素［2］。当血管内皮细胞受损时，其功能发生失调，会导致脑缺血、动脉粥样硬化、心肌梗死、高血压等心血管疾病的发生［3，4］。VEC作为一 种抗血栓形成细胞，其分泌的生物活性物质在抗凝、纤溶和抗血小板活化等方面有重要的意义［5］。乳酸脱氢酶（LDH）是活细胞的内含酶之一，其释放率的变化可以体现出细胞膜通透性的改变，当细胞膜受损严重时，胞浆中的LDH 将释放到培养液中，培养液中LDH 酶的活性会显著升高，培养液中LDH 含量多少可反映细胞膜的损伤程度，因此细胞外液中的LDH 活性增加是细胞损伤的重要标志之一［6］。内皮素－1（ET－1）是由血管内皮细胞合成和分泌的一种血管活性肽，是调节血管舒缩功能的主要因子，是迄今所知最强的缩血管物质［7］，可引起血管强烈收缩并刺激一些舒血管活性物质的释放、刺激血管平滑肌细胞增殖和血管重构、促进成纤维细胞有丝分裂、调节血管通透性激活炎症细胞等。全蝎具有熄风镇痉、消炎攻毒、通络止痛，能抑制血小板的活化聚集、直接抑制凝血酶－纤维蛋白原反应和促进纤溶系统活性等因素，从而抑制血栓形成。为进一步探讨其作用机制，本研究以凝血酶－血管内皮细胞为实验对象，探究全蝎纯化液对凝血酶诱导HUVEC释放LDH、ET－1的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 超净台（SW－CJ－1CV，苏净安泰公）、倒置相差显微镜（OLYMPUS，日 本）、CO2培 养 箱（SHEL－LAB，Hitachi，美国）、酶标仪（芬兰Labsystens集团）。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）武汉大学典型物种保存中心提供。胰蛋白酶、RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），新生小牛血清（杭州四季青生物制品研究所产品）。磷酸缓冲盐（PBS）干粉（武汉博士德公司产品）。凝血酶（中国医学科学院血液学研究所产品）。全蝎（购于湖南省医药公司）经水煮醇沉、凝胶过滤、离子交换层析等分离纯化过程将其真空冷冻干燥成粉末，－20℃保存备用，用RPMI 1640培养液（含10%小牛血清）配成所需浓度工作液，0.22μm 微孔滤膜过滤除菌。

1.2 内皮细胞培养及鉴定 将血管内皮细胞加入RPMI 1640培养液（含10%小牛血清、100 U／mL 青霉素、100 U／mL 链霉素）中，体积分数5%、37℃恒温二氧化碳培养箱中培养，倒置显微镜下观察内皮细胞呈梭形或多角形、铺路石样镶嵌式单层细胞排列，待细胞长成单层后，弃去培养液，用0.25%胰蛋白酶消化传代，经Ⅷ因子（FⅧ）免疫荧光鉴定并选择生长良好的HUVECs用于实验。

1.3 实验分组及药物处理 选取生长良好的2～3 代内皮细胞。将融合生长的细胞用0.25%胰蛋白酶消化吹打制成单细胞悬液，根据预实验结果调节细胞密度为7.5×104／mL，接种于96孔培养板中，每孔200μL。37℃、体积分数5%CO2条件下培养。培养的内皮细胞融合后，随机分为：空白对照组（等量培养液），凝血酶刺激组（培养液＋10U／mL 凝血酶），全蝎纯化液高、中、低剂量组（10U／mL 的凝血酶后分别＋24μg／mL、12 μg／mL、6μg／mL全蝎纯化液）。每组设10个复孔，置5%CO2、37 ℃培养箱中培养12h进行检测。

1.4 指标检测 采用比色法测定LDH 活性，试剂盒购自南京建成生物工程研究所；采用放射免疫法测ET－1的含量，试剂盒购自北京北方生物技术研究所。严格按试剂盒操作说明书操作步骤进行。

2 结 果

2.1 全蝎纯化液对凝血酶诱导HUVECs表达LDH 影响 与对照组比，凝血酶能明显促进HUVECs漏出LDH（P＜0.01），而全蝎纯化液各组培养液中LDH 与凝血酶组比较有统计学意义（P＜0.01）。LDH 漏出减少。详见表1。

表1 全蝎纯化液对凝血酶诱导血管内皮细胞释放LDH、ET－1的影响

表1 全蝎纯化液对凝血酶诱导血管内皮细胞释放LDH、ET－1的影响

与空白组比较，1）P＜0.01；与凝血酶组比较，2）P＜0.01

组别 n LDH（U／L） ET－1（ng／L）空白组 10 651.21±106.32 12.10±0.98凝血酶组 10 1 560.37±201.231） 34.02±1.081）全蝎大剂量组 10 985.53±113.152） 14.36±0.882）全蝎中剂量组 10 1 123.16±139.612） 17.82±0.942）全蝎小剂量组 10 1 261.10±109.332） 19.62±0.962）

2.2 全蝎纯化液对凝血酶诱导HUVECs释放ET－1的影响凝血酶刺激后ECV 分泌ET－1增加，培养上清液中ET－1含量显著高于空白组（P＜0.01），而全蝎纯化液各剂量组培养上清液中ET－1含量均显著低于凝血酶组（P＜0.01）。详见表1。表明凝血酶刺激ECV 可诱导其分泌增加，全蝎纯化液对其分泌具有抑制作用。

3 讨 论

血管内皮细胞存在于全身组织器官，连接组织和血液，作为最先感受机体内环境变化的细胞之一，凭借对血管张力、炎症、纤溶与凝血和对活性氧族的调节成为血管体内稳态的主要参与者［8］。血管内皮细胞的完整性是维持正常血流状态、血管通透性及防御反应的基础，因此内皮细胞在体内促凝和抗凝平衡中起着举足轻重的作用。内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞生物学与多种疾病关系的重要方法，其抗血栓形成在血栓栓塞性疾病中的作用也得到公认和证实。

近年来研究发现，乳酸脱氢酶属氢转移酶，主要催化体内乳酸氧化成丙酮酸，是糖酵解过程中一种重要的酶。广泛分布于人体组织中，是细胞代谢状态非常敏感的指标，可反映缺氧、无氧酵解、活性状态和恶性转化，任何原因引起的组织细胞损伤均可引起LDH 活性增加。正常情况下，血清LDH 的含量低于细胞组织的1‰，当组织损伤或细胞代谢紊乱时，LDH 可从组织或细胞内释放到血液导致血清中LDH 活性显著增加。故血清LDH 活性水平很大程度可以反映富含LDH 细胞的增殖、代谢等生物学性状［9］。本实验研究结果显示，凝血酶刺激HUVEC大量增加LDH 的漏出，提示凝血酶刺激ECV 后，细胞代谢活性降低，同时全蝎纯化液各组培养液中LDH 与凝血酶比较，LDH 漏出减少，提示凝血酶可抑制ECV 代谢，促进内皮细胞LDH 的漏出，对内皮细胞呈损伤作用，而全蝎纯化液能抑制受损的血管内皮细胞的LDH 漏出。

内皮素（ET）是由21个氨基酸组成的多功能生物活性肽，是血管内皮损伤的重要标志物。ET 有3种亚型，但只有ET－1是由血管内皮细胞合成，是目前已知作用最强的内源性血管收缩肽，ET－1有收缩血管、血小板聚集及平滑肌增殖等功能，能够协同生长因子，促进生长因子促平滑肌增殖。ET－1 与G 蛋白偶联受体ET A 结合后，可介导平滑肌细胞依赖的血管收缩效应，若内皮细胞受损，血管内皮细胞分泌的ET－1增多，可调控平滑肌增殖的细胞因子和介导炎症反应，促进血管疾病的加重［10，11］。本实验结果表明，凝血酶刺激HUVEC大量释放ET－1，而全蝎能明显抑制凝血酶所诱导的ET－1释放。全蝎纯化液可抑制凝血酶诱导的LDH 漏出和ET－1的释放，这可能是全蝎抗血栓形成的作用机制之一。

［1］ 易小民，谭茜，彭延古，等.全蝎纯化液对凝血酶诱导血管内皮细胞释放血管性血友病因子和6－酮－前列腺素F1a的影响［J］.中国中西医结合急救杂志，2010，17（6）：334－336.

［2］ 田海涛，曹芳英，朱智明，等.心血管疾病不容忽视的问题：血管内皮细胞损伤［J］.转化医学杂志，2013，2（3）：173－176.

［3］ Panza JA，Quyyumi AA，Brush JE，et al.Abnormal endotheliumdependent vascular relaxa tion in patients with essential hypertension［J］.N Engl J Med，1990，323（1）：22－27.

［4］ 周颖，陈虹.血管内皮细胞功能紊乱与心血管疾病关系的研究进展［J］.现代生物医学进展，2006，6（8）：63－65.

［5］ 杨洁红，张宇燕，王华锋.养阴益气活血方对培养人脐静脉内皮细胞抗凝和纤溶功能的作用［J］.中国中西医结合急救杂志，2008，15（1）：3－5.

［6］ 郭晶，宋文华，丁峰.萘醌类化合物对HL－7702细胞LDH 释放率以及线粒体膜电位的影响［J］.南开大学学报，2012，45（4）：1－6.

［7］ 彭良富，杨期明，廖远高.偏头痛患者血浆内皮素－1含量的变化研究［J］.华夏医学，2006，19（2）：252.

［8］ 乔华，何胜虎.血管内皮细胞功能检测方法及意义［J］.实用心脑肺血管志，2010，18（4）：531－533.

［9］ 巩国亭，管洪在.急性淋巴细胞白血病患者血清IL－12、IFN－γ及LDH 测定的临床意义［J］.山东医药，2007，47（4）：5－6.

［10］ Barton M.Reversal of proteinuric renal disease and the emerging role of endothelin［J］.Nat Clin Pract Nephro，2008，4（9）：490－501.

［11］ Zhang X，Zhao F，Xu C，et al.Circadian rhythm disorder of thrombosis and thrombolysis related gene expression in apolipoprotein enock－out mice［J］.Int J Mol Med，2008，22（2）：149－153.