两种病原真菌在河南危害烟草的首次报道

苗 圃，王海涛，李淑君，康业斌*

（1.河南科技大学林学院，河南 洛阳 471003；2.河南省烟草公司烟草研究所，河南 许昌 461000）

全国16个主产烟省（区）烟草侵染性病害62种，其中真菌性病害30种；河南省侵染性病害29种，其中真菌性病害14种[1]。此后又报到了烟草镰刀菌根腐病（Fusarium solani）[2]、烟草丛顶病（TBTV、TVDV）[3]、烟草靶斑病（Thanatephorus cucumeris）[4]、烟草黑脚病（Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum strains）[5]等新病害。随着烟草农业不断向规模化和集约化方向发展，烟草种植不可避免的采用多年连作，导致土传病害危害程度增加，老病害逐步加重，新病害相继出现。笔者在此报道河南洛阳烟田发现的两种烟草病害的病原菌鉴定结果。

1 材料与方法

1.1 病原菌分离

2011年7月，河南省嵩县烟草公司送检的烟草病株，在茎的近土面处产生褐色水渍状病斑，主根与支根出现褐色病斑，严重者呈水渍状腐烂（图1a），对病部进行常规组织分离，获得Ⅰ号菌株。

2012年8月，在河南省洛宁县烟田采集的烟草病株，病茎上出现不规则形灰白色病斑，边缘清晰，其上密布不规则排列的小黑点（图 2a），对病部进行常规组织分离，获得Ⅱ号菌株。

1.2 形态学鉴定

图1 茎黑腐病及其病原菌形态Fig.1 Tobacco Black Stem Rot and the pathogen

图2 壳二孢茎枯病及其病原菌形态Fig.2 Ascochyta Stem Wilt disease and the pathogen

两个菌株分别在燕麦培养基和PDA培养基上培养3～5 d后，用直径5 mm的打孔器打取菌饼，转接于燕麦及PDA平板中央，25 ℃光/暗（12 h/12 h）培养，7 d后观察菌落特征，在显微镜下观察并测量子实体大小。

1.3 分子生物学鉴定

刮取培养5～7 d的菌丝体50 mg，采用CTAB法[6-7]提取两个病菌的基因组 DNA。利用通用引物ITS1和ITS4对所提取的DNA进行PCR扩增，反应在25 μL反应体系中进行。PCR反应程序为：94℃预变性5 min；进入循环，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸105 s，30个循环；最后72 ℃补平10 min，4 ℃保存。取5 μL扩增产物，用1%琼脂糖凝胶于1×TAE电泳缓冲液中电泳，用DNA Marker做对照，以凝胶成像系统检测PCR扩增产物大小，观察到合适的条带后，将所对应的原始扩增产物（未纯化）40 μL寄往上海生工测序。

1.4 致病性测定

Ⅰ号菌株采用菌丝块接种，选取健康的中烟100烟株，用灭菌的大头针刺伤茎基部表皮，将菌丝块贴于伤口，并用蘸取无菌水的脱脂棉包裹，25℃保湿培养。以琼脂块接种做对照。

Ⅱ号菌株采用孢子悬浮液针刺接种，制备孢子悬浮液并调整浓度为 1×106个/mL，选取健康的中烟100茎杆，用灭菌的大头针刺伤茎部表皮，用脱脂棉蘸取孢子悬浮液并包裹在伤口处，25℃保湿培养。以无菌水接种做对照。

2 结 果

2.1 形态学鉴定

Ⅰ号菌株在燕麦培养基上菌落圆形，白色，长势较快，呈放射型，并逐渐变为花瓣型，边缘整齐，气生菌丝稀薄（图 1c）。部分老熟菌丝有分隔，菌丝直径 1.8～3.9 μm，平均 2.7 μm（图 1d）；孢子囊多球形，少数梨形，顶生或间生，直径7.7～19.4 μm，平均14.0 μm（图1e、图1f）；雄器钟状或不规则，顶生，多同丝生；藏卵器球形，平滑，顶生，有时间生或切生，直径 14～27 μm（平均 21.5 μm），每个藏卵器有一个雄器；卵孢子球形，不满器（图1g、图1h、图1i），根据以上形态学特征，将其鉴定为腐霉属（Pythium sp.）。

Ⅱ号菌株在 PDA培养基上菌落初期白色，绒毛状，边缘整齐，菌落中部逐渐变为青黑色，边缘白色（图 2d）。分生孢子器极少，分生孢子卵圆形至梭形，无色，双胞或单胞，双胞大小 13.2～18.1 μm×2.6～7.7 μm，平均 14.2 μm×5.1 μm（图 2e），单胞大小 3.1～9.8 μm×2.3～ 4.6 μm，平均 6.6 μm×2.9 μm（图2f）。培养12～15 d产生子囊壳、子囊及子囊孢子，子囊壳极少（图2-g），子囊棍棒状，基部收缩呈短柄，大小 51.6～98.0 μm×7.7～11.6 μm，平均61.0 μm×9.1 μm（图2h），子囊内含8个子囊孢子，纺锤形，双胞，上大下小，隔膜处有缢缩，大小 15.5～18.1 μm×5.2～8.3 μm，平均 16.4 μm×6.8 μm（图 2I），根据以上形态学特征，将其无性时期鉴定为壳二孢属（Ascochyta sp.），有性时期鉴定为Didymella sp.。

2.2 分子生物学鉴定

对Ⅰ号菌株进行rDNA-ITS序列测定，获得有效序列长度609 bp，在GenBank上进行BLAST比对，并使用Clustal_X（1.83）软件对自测序列以及从GenBank下载的相关序列进行较准（alignment）后，以距离法（Neighbor-joining法）[8]利用MEGA5软件[9]构建系统发育树（图3）。结果表明，该序列与登录号为 GU133578.1和 GU133597.1等的Pythium vexans（钟器腐霉）亲缘关系最近，ITS序列同源性99%。

对Ⅱ号菌株进行rDNA-ITS序列测定，获得有效序列长度475 bp，在GenBank上进行BLAST比对，同上方法构建系统发育树（图4）。结果表明，该序列与登录号为AY157876.1和AY157883.1等的Didymella ligulicola 亲缘关系最近，ITS序列同源性100%。

2.3 致病性

Ⅰ号菌株菌丝块接种5 d后，茎基部接种点呈深褐色，并逐渐向上下扩展（图1b）。将发病部位做组织分离，重新获得病原菌。

图3 Ⅰ号菌株与GenBank上的相关序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of the strain I and correlation sequences

图4 Ⅱ号菌株与GenBank上的相关序列系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of the strain II and correlation sequences

Ⅱ号菌株孢子悬浮液针刺接种7 d后，在针刺周围可见突出于表皮的斑点，并逐渐突破表皮而外露，形成不规则排列的小黑点（图2b、图2c）。挑取小黑点在PDA上培养，重新获得病原菌。

3 讨 论

钟器腐霉（Pythium vexans）属鞭毛菌亚门（Mastigomycotina）藻菌纲（Phycomycetes），霜霉目（Peronosporales），霜霉科（Pythiaceae），腐霉属（Pythium）。目前全世界报道的腐霉有200多种，其中超过 80种为植物重要的病原菌，危害多种作物，引起猝倒、根腐和茎腐等症状，如瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、德巴利腐霉（Pythium debaryanum）和终极腐霉（Pythium ultimum）均能侵染烟草引起猝倒病[10]。钟器腐霉在马来西亚、印尼、印度、日本、巴西、英国、美国等 27个国家或地区广泛分布[11-12]，在我国云南、海南、广西、宁夏、北京和陕西等地均有报道[13]，能危害马铃薯、山药、蔬菜和茶叶等 50种以上的经济作物，而在河南省危害烟草尚属首次报道。

菊花疫病菌（Didymella ligulicola, 同物异名：Mycosphaerella ligulicola）属子囊菌亚门（Ascomycotina），子囊菌纲（Ascomycetes），座囊菌目（Dothideales），座囊菌科（Dothideaceae），球腔菌属（Mycosphaerella）；无性时期为菊花壳二孢（Ascochyta chrysanthemi），属半知菌亚门（Deuteromycotina），球壳孢目（Sphaeropsidales），球壳孢科（Sphaeropsidaceae），壳二孢属（Ascochyta）[14]。壳二孢属在世界上分布广泛，寄主范围广，种类繁多，目前全世界报道的壳二孢种类超过 1400种，多数为农作物等的病原菌[15]，其中烟草壳二孢（Ascochyta nicotianae）危害烟草引起破烂叶病，该菌最早发现于意大利帕尔马地区，高加索地区、法国、奥地利、德国、丹麦和美国等都有发生[16]，我国分布也较广。国外报道菊花壳二孢首要寄主为菊花，人工接种可侵染大丽花、洋蓟、莴苣、太阳花等多种园艺植物[17]，我国福建、浙江和河北等地也有该菌侵染菊花引起菊花花腐病的报道[18]，而菊花壳二孢侵染烟草属首次报道，作者将该菌为害烟草引起的病害命名为烟草壳二孢茎枯病。

4 结 论

根据两个菌株的形态特征和DNA序列测定比对结果，并参考国内外文献资料，将Ⅰ号菌株鉴定为钟器腐霉（Pythium vexans de Bary），该病菌可引起烟草猝倒病。将Ⅱ号菌株有性时期鉴定为为菊花疫病菌[Didymella ligulicola（K.F.Baker, Dimock&L.H.Davis）von Arx]，同物异名菊花花腐病菌(Mycosphaerella ligulicola K.F.Baker)，无性时期为菊花壳二孢（Ascochyta chrysanthemi F.L.Stev.），该病菌引起烟草的一种新病害——壳二孢茎枯病。

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