β2肾上腺素能受体激动剂/拮抗剂对大鼠成骨细胞骨碱性磷酸酶比活性的影响

彭 莉，李双庆

(1上海市浦东新区公利医院，上海200135;2四川大学华西金卡医院)

研究发现，骨量的调控不仅取决于激素水平、营养状态、物理因素、免疫功能和遗传基因，交感神经系统(SNS)也可对骨量调控发挥重要作用。Pasco等［1］研究发现，β肾上腺素能受体拮抗剂能增加骨密度，降低骨折的危险性。Levasseur等［2］发现，悬吊大鼠喂食普萘洛尔后大鼠股骨远侧干骺端骨密度较未悬吊组及安慰剂组高。SNS广泛分布于外周组织器官，成骨细胞(OB)和骨小梁附近有交感神经纤维存在，OB和破骨细胞(OC)上都具有β2肾上腺素能受体(ADRβ2R)［3］。骨碱性磷酸酶(bALP)是 OB的表型标志物之一，可直接反映OB的活性或功能状态。2007年 9月 ～2008年 3月，我们观察ADRβ2R激动剂/抑制剂作用于OB后对bALP比活性的影响，并探讨SNS对骨代谢的调节机制。

1 材料与方法

1.1 材料 新生(24 h)SD大鼠颅盖骨分离得到的OB(大鼠来自四川大学华西基础与法医学院动物实验室)。主要试剂:DMEM-HG培养基、胎牛血清(GIBCO);胰蛋白酶、沙丁胺醇、ICI-118551(美国Sigma公司);碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。主要仪器:CO2细胞孵箱(Heraeus);Olympus IX50倒置相差显微镜(日本Olympus公司);YJ-2450医用净化工作台(苏州净化设备厂);LD5-2A型台式离心机(北京医用仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 OB分离、提取、培养 将10只SD大鼠浸泡于75%乙醇中，取出后经过无菌处理，将颅骨片剪成大小约1 mm×1 mm×1 mm骨片，加入胰蛋白酶消化。弃去胰蛋白酶，用培养基清洗数次，将骨片放入培养瓶中做翻转培养。加入适量培养基，使之恰好浸没骨片。标记细胞类型、日期和代数，置于孵箱中培养，至少3 d后再观察细胞贴壁情况。待细胞从骨片周边呈放射状长出后，换液，并小心弃去骨片，以后每3 d换液1次。细胞融合时，进行消化传代。第1代传代细胞标记为P1;培养细胞再度融合时，依次传代，标记为 P2、P3。

1.2.2 OB鉴定 取P3做细胞ALP重氮盐法染色及矿化结节茜素红S染色进行OB鉴定。

1.2.3 bALP比活性检测 取P3OB接种于6孔培养板和96孔培养板中继续培养，将OB随机分成3组，即ADRβ2R激动剂组(A 组)、ADRβ2R 拮抗剂组(B组)、生理盐水组(对照组)，A、B组分别加入不同浓度的沙丁胺醇、ICI-118551进行干预。干预培养后第24、72、96 h分别使用AKP测定试剂盒和考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，按照试剂盒规定的操作步骤操作，分别测出bALP总活性和总蛋白量，然后计算出bALP比活性值。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件，计量资料以±s表示，多组之间均数比较使用方差分析。如方差齐，两两比较用LSD法;如方差不齐，两两比较用Tamhane＇s法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OB的培养及鉴定 原代培养第9～12天，细胞可融合80% ～90%。传代培养的OB 3～4 h开始贴壁，6～8 h贴壁完全，细胞有数个突起，突起的个数和形态各不相同。传代培养4～6 d后细胞融合成单层。继续培养，细胞突起互相连接，并可重叠生长而不发生细胞间接触抑制现象，重叠生长的细胞逐渐形成结节状，随后胶原堆积及钙盐沉积，最后形成不透光的矿化结节。倒置相差显微镜下观察，细胞呈多角形、长棱形、不规则形，有较多突起，胞核明显，呈卵圆形，可见1～3个核仁，胞质透亮、饱满。通过细胞ALP重氮盐法染色和矿化结节茜素红S染色鉴定为OB。

2.2 各组OB培养24、72、96 h的bALP比活性 A组bALP比活性随浓度增加而逐渐下降，B组bALP比活性随浓度增加而逐渐上升。A、B组bALP比活性随时间延长逐渐上升。各组在24 h变化幅度较小，72、96 h变化幅度较大。24 h，A、B组与对照组相比差别无统计学意义(P均＞0.05);72、96 h，A、B组与对照组相比差别有统计学意义(P均＜0.05)。见表1。

表1 各组OB培养24、72、96 h的bALP比活性(U/g)

3 讨论

新近研究发现，SNS在骨量的调控中发挥着关键作用。Cherruau等采用胍乙啶破坏交感肾上腺素能纤维的作用，发现切断交感神经后降钙素相关肽免疫反应神经纤维(CGRP)的数目增加，通过OB和OC上的CGRP受体可促进OB分化增殖及抑制OC分化和成熟功能［4，5］。骨质疏松患者的OB骨形成能力降低，骨丢失大于骨形成导致骨量减少。OB在骨代谢中扮演着重要角色，它的分化成熟、功能活动以及凋亡决定了代谢过程中骨的形成与矿化的程度。激素、细胞因子等调控着OB的活动，但它们影响OB活动的行为与OB上表达的受体有着密切关系。OB和OC上都具有ADRβ2R，该受体激活刺激骨髓OC生成而导致骨量的下降;相反，抑制该受体则会促进骨形成，增加骨量。bALP比活性反映了细胞的成骨活性，其作用是水解有机磷酸酶释放出无机磷，用于羟磷灰石的形成，是骨形成的特异指标。因此，我们推测SNS可能影响成骨细胞的bALP比活性，从而调节骨代谢。

体外获取OB的方法有很多。本实验提取24 h内出生的SD乳鼠头盖骨，采用骨组织块贴壁培养法获取OB。该方法操作简单易行，换液和传代时采用差速贴壁法可以获得相对纯化的OB。原代培养3 d后可见少数OB自颅骨碎片移出，随时间延长，移出的OB增多，并且以骨片为中心，向周围放射状生长。传代培养的OB形态与原代相似。目前对OB在体外培养中鉴定检测，除了细胞形态学的观察外，主要是通过检测OB所分泌的骨组织细胞外基质来反映其功能和成骨能力。本研究细胞内ALP重氮盐法染色结果和矿化结节茜素红S染色结果，证明实验培养的细胞为OB。

本研究将培养的P3新生SD大鼠OB给予不同浓度的ADRβ2R激动剂和ADRβ2R拮抗剂处理，结果显示各OB组bALP比活性随ADRβ2R激动剂剂量增加逐渐降低，随ADRβ2R拮抗剂剂量增加而逐渐上升;变化具有时间依赖性，以96 h改变最明显。本结果表明ADRβ2R激动剂能降低bALP比活性，从而抑制OB的成骨能力，ADRβ2R抑制剂则提高bALP比活性，而促进成骨细胞的成骨能力。说明交感神经递质可以通过ADRβ2R调节OB的活动，从而影响骨代谢。

［1］Pasco JA，Henry MJ，Sanders KM，et al.Beta-adrenergic blockers reduce the risk of fracture partly by increasing bone mineral density:geelong of teoporsis study［J］.J Bone Miner Res，2004，19(1):19-24.

［2］Levasseur R，Sabatier JP，Potrel-Burgol C，et al.Sympathetic nervous system as transmitter of mechanical loading in bone［J］.Joint Bone Spine，2003，70(6):515-519.

［3］盛健，崔燎.下丘脑—瘦素—交感神经系统和骨量的调控［J］.国外医学:内分泌学分册，2005，(5):333-335.

［4］Cherruau M，Morvan FO，Saffar JL.Chemical，sympathectomy-induced changes in TH-，VIP-，and CGRP-immunoreactive fibers in the rat mandible periosteum:influence on bone resorption［J］.J Cellular Physiol，2003，194(3):341-348.

［5］韩庆林，苟三怀，王琪.降钙素基因相关肽(CGRP)调控成骨细胞功能研究进展［J］.中国矫形外科杂志，2005，13(7):544-549.