毛细管电泳分离蛋白质的研究进展

宫红梅

摘 要 综述了无胶筛分毛细管电泳在和蛋白质的分离分析中的应用实例，对这种方法的前景展望及发展趋势进行

讨论。

关键词 高效毛细管电泳；无胶筛分；蛋白质；电渗流

中图分类号：O629.73 文献标识码：A 文章编号：1671-7597（2014）07-0160-01

近年来，蛋白质组学的研究进展迅速，其中研究热点集中于蛋白质的分离检测与结构鉴定上。目前有关蛋白质的研究手段和方法较多，各有优缺点。毛细管电泳技术具有高效、快速、样品用量极少等特点，适合生物大分子的分析检测。但毛细管电泳分离蛋白质时，首先要解决的问题是蛋白质样品对管壁的吸附。

无胶筛分毛细管电泳是在缓冲溶液中添加线性高分子而不进行交联反应，溶液中高分子之间相互交缠形成网孔，从而对蛋白质等生物大分子按其大小进行筛分分离，无胶筛分的机制还不明确，存在几种理论模型：交缠溶液理论和高分子亚浓溶液线团收缩理论，Ogston、爬行和偏爬行模型和碰撞模型[1]。高分子溶液加入到缓冲液中，使电渗流得到抑制，同时也抑制了蛋白质的吸附，与凝胶电泳相比，它的制备工艺相对简单，寿命较长，操作简便，容易清洗等优点。

传统的SDS-凝胶电泳分离蛋白质的分辨率低，操作繁琐耗时，且所用药品有毒性，毛细管凝胶电泳可以克服上述缺点，但制备工艺复杂，凝胶寿命短，填充过程中容易产生气泡，影响分离。无胶筛分电泳具有更多的优点，容易填充和冲出，高分子聚合物在管中形成动态筛分网络，能很好的保持操作重现性，而且可以抑制电渗流，减少吸附。而且可以选择筛分介质的种类，浓度，分子量，以适合分离不同的蛋白质混合物。

1 无胶筛分毛细管电泳的应用

目前，无胶筛分体系已较多应用于低聚核苷酸、DNA限制性片段、聚合酶链反应产物的分离研究领域中。郭栩等人根据实验结果得出结论，在无胶筛分体系中，尽管影响分离的主要因素在于筛分体系本身，但柱壁的处理对DNA片段的分离结果也不可忽视[3]。

李克，袁倚盛等在硼酸缓冲溶液中加适量的PEG8000作为改性剂，以非涂渍毛细管柱电泳分离人血清蛋白质，血清样品经硼酸缓冲液（50 mmol/L，pH=8.80）稀释后，以0.1 mol/L的硼酸缓冲液（pH9.35，PEG8000为4 g/L）为电泳介质，在50 μm×37 cm弹性石英毛细管柱（Leff=32 cm）中进行电泳分离，在紫外波长200 nm处检测，12 min内便可完成对血清中蛋白质的电泳分离。方法简便、快速、峰迁移重复性好，适用于临床常规检验和血中蛋白质的研究。张振中，吴逸明等以线性高分子聚合物聚乙二醇（PEG20000）作为筛分介质，150 mmol/L Tris -100 mmol/L CHES（pH8.7）作为运行缓冲液，运行电压20 kV，磷酸化酶B、牛血清白蛋白、肌动蛋白、碳酸酐酶、烟草花叶病毒外壳蛋白和胰蛋白酶抑制剂达到基线分离。随PEG相对分子质量的不同PEG的性质发生改变，相对分子质量大小决定了其链的长短及筛孔径的大小，也就决定了被分离的蛋白质的相对分子质量范围。因此选定合适的PEG，优化实验参数是实验的关键工作。在实验中应根据赵京山，温进坤等人建立了检测微量蛋白质方法，电泳缓冲液为含有30 g/L PEG 20000硼酸盐缓冲液150 mmol/L，pH10.0，骨桥蛋白标品的倍比稀释，依次经NGSCE方法检测，确定所建方法的灵敏度及峰面积和OPN浓度之间的关系；利用回收实验，根据OPN的浓度和峰面积计算回收率。结果表明，该无胶筛分毛细管电泳的方法能满足检测微量蛋白质的需要[3]。

Garcia-Ruiz等[4]分离牛乳清蛋白（α-乳清蛋白和β-乳球蛋白（A+B））和大豆蛋白时使用的是羟乙基甲基纤维素/尿素体系。Rumbo等[5]同样用无胶筛分体系成功分析50多种结构相似、理化性质接近的麦胶蛋白。Bean等通过比较几种不同的筛分介质在SDS-CE中的分离效果，建立了简捷，快速，重现性好的分离小麦蛋白的方法。Somerville等[6]用无胶筛分体系实现了临床应用的糖细胞集落刺激因子（G-CSF）的异构体的

分离。

2 影响因素及控制

zeta电势是影响电渗流的主要因素，缓冲液性质、毛细管表面特性都与电势大小密切相关。同时，zeta电势与扩散层厚度成正比，而扩散层厚度又与电解质浓度的平方根倒数成正比，所以，缓冲溶液的组成、酸碱度、毛细管内壁表面的活化状态以及环境温度成为影响电渗流的间接因素，此外，当其他条件一定时，电场强度也影响电渗流的大小。控制方法有改变缓冲液的特性，对柱表面进行处理，外加径向电场。

分离酸性蛋白质时，采用pH7-10的缓冲体系，可以减少蛋白质对管壁的吸附。不同的缓冲离子类型会对电渗流以及蛋白质样品有不同的作用，硼酸-硼砂缓冲溶液和Tris-HCl缓冲溶液的分离能力优于磷酸盐缓冲液，能得到较好的峰形和较快的迁移时间；分离体系的pH值对分离度及柱效有很大影响，要根据样品蛋白质的性质选择合适的pH值。

缓冲溶液中通过添加筛分介质，运行缓冲溶液的粘度变大，需要增长进样前缓冲液冲洗平衡毛细管的时间。通过进样后的加压分析研究，发现分离结果并未得到实质改善，原因尚未明确，需要进一步实验验证；添加适当比例的有机溶剂如甲醇，可以减小溶液粘度，降低焦耳热，从而改善峰形，添加比例增大时，峰形变差，迁移时间延长。

3 结束语

毛细管电泳分离蛋白质具有其高效、快速、样品量少、溶剂量少等特点，但对于实际蛋白质研究还存在一些问题，如吸附问题、分辨率问题、复杂组分的干扰等。各种新的分离模式和探索正在进行中。毛细管电泳无胶筛分蛋白质的研究目前在国内外的报道还不太多，而筛分机理还不明确，因此进一步的研究十分有意义。目前的研究主要是在筛分介质的选择和分离条件上的改进，建立更多的分离模式，使其具有实用性，并用于蛋白质和蛋白质组学研究有着广阔的发展前景。

参考文献

[1]丁文静，许旭.基于纤维素衍生物的毛细管无胶筛分电泳及其应用[J].分析科学学报，2004，20（2）：204-209.

[2]周欣.高分子材料在无胶筛分毛细管电泳中的应用[J].医学综述，2006，12（7）：437-438.

[3]郭栩，余胜兵.毛细管无胶筛分电泳涂渍柱的制备和性能考察[J].分析化学，1996，24（7）：853-857.

[4]李克，袁倚盛.高效毛细管区带电泳法分离人血清蛋白质的研究[J].色谱，2000，18 （2）：152-154.

[5]张振中，吴逸明.无胶筛分毛细管电泳在蛋白质分离中的应用[J].河南医科大学学报，2000，35（3）：230-232.，

[6]赵京山，温进坤.无胶筛分毛细管电泳检测微量蛋白质方法的建立与评价[J].河北医科大学学报，2005，26（2）：27-128.endprint