赤子爱胜蚓Eisenstasin样蛋白cDNA和氨基酸序列分析

于保锋，刘志贞，张悦红，解 军，程牛亮，王建华，牛 勃，(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，太原 0000;山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室;首都儿科研究所生物技术研究室;通讯作者，E-mail:niub004@6.com)

蚯蚓是传统医学中的重要药材之一，现代研究表明其提取物具有抗凝［1，2］和抗肿瘤［3，4］等作用。本课题组从赤子爱胜蚓cDNA文库中获得一cDNA序列，经初步分析，其编码的蛋白属于新蛋白，序列比对表明，其编码序列与Eisenstasin和Antistasin蛋白具有同源性，可能具有抗凝和抗肿瘤转移等生物学活性，为进一步的研究其结构和功能奠定基础，现报道如下。

1 材料与方法

从本室构建和保存的赤子爱胜蚓cDNA文库中经随机测序获得本目标cDNA序列，利用基因和蛋白质分析处理软件DNAMAN、NCBI ORF finder、BLAST、Conserved Domains、GOR、SWISS－MODEL等软件对该目标的基因序列和氨基酸序列进行分析。

2 结果

2.1 Eisenstasin样蛋白的cDNA序列

采用美国ABI公司3730基因测序仪，测序结果得到的Eisenstasin样蛋白的cDNA序列如下:

DNAMAN软件分析得到，序列总长度565 bp;碱基组成:165 A，118 C，152 G，130 T;碱基组成百分比:29.2%A，20.9%C，26.9%G，23.0%T;分子量(molecular weight，单位:kD):ssDNA(单链 DNA):175.27，dsDNA(双链 DNA):348.31。

2.2 Eisenstasin样蛋白的氨基酸序列

将上述cDNA序列用NCBI ORF finder软件(网址 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)进行分析，得到其氨基酸序列如下:

氨基酸用大写英文字母的一字缩写表示，可见读码框架从cDNA序列的第120位核苷酸开始，起始密码ATG对应甲硫氨酸(英文缩写M)。共编码148个氨基酸残基。

2.3 Eisenstasin样蛋白cDNA序列的同源比对

将上述Eisenstasin样蛋白的cDNA序列用在线nucleotide blast工具进行同源比对，结果如图1(见第339页)所示，可见有3个命中结果序列。与目标序列同源度最高的命中序列为Eisenia andrei Eisenstasin I mRNA的编码序列，两者核苷酸的相似度为78%(148/190，见图2)。相似度次之的为Eisenia andrei EisenstasinⅡ mRNA的编码序列，两者核苷酸的相似度为72%(187/260，见图3)。

图2 Eisenstasin样蛋白与EisenstasinⅠcDNA序列的比对Figure 2 Comparison of sequences between Eisenstasin-like protein and EisenstasinⅠcDNA

图3 Eisenstasin样蛋白与EisenstasinⅡcDNA序列的比对Figure 3 Comparison of sequences between Eisenstasin like protein and EisenstasinⅡcDNA

2.4 Eisenstasin样蛋白氨基酸序列的同源比对

将上述Eisenstasin样蛋白的氨基酸序列用在线protein blast工具进行同源比对，可见有359个命中结果序列(图4，见第339页)。与目标序列同源度最高的命中序列为Eisenia andrei EisenstasinⅡ的氨基酸序列，两者氨基酸的相似度为37%(61/166，见图5)。

2.5 Eisenstasin样蛋白cDNA序列中保守结构域分析

将Eisenstasin样蛋白cDNA序列用NCBI Conserved Domains工具进行分析，检索其序列中可能存在的保守功能结构域，结果显示目标序列中存在3段Antistasin家族保守结构域(图6，见第339页)。该保守结构域中的共有氨基酸序列(图7，见第340页)。

2.6 基于Eisenstasin样蛋白氨基酸序列的二级结构预测

图5 Eisenstasin样蛋白与EisenstasinⅡ氨基酸序列的比对Figure 5 Comparison of Eisenstasin-like protein and EisenstasinⅡamino acid sequence

将上述Eisenstasin样蛋白的氨基酸序列用蛋白质二级结构预测在线工具GORⅣ进行分析，预测结果如图8(见第340页)所示，148个氨基酸残基中，44个(29.73%)氨基酸残基主要形成β折叠结构，其余104个(70.27%)氨基酸残基主要形成无规卷曲(random coil)结构，没有出现α螺旋和β转角的二级结构形式。对Antistasin蛋白的二级结构进行同法预测，220个氨基酸残基中，12个(5.45%)氨基酸残基主要形成α螺旋结构，42个(19.09%)氨基酸残基主要形成β折叠(extended strand)结构，其余166个(75.45%)氨基酸残基主要形成无规卷曲(random coil)结构。

2.7 Eisenstasin样蛋白三级结构预测

将上述Eisenstasin样蛋白的氨基酸序列用蛋白质三级结构预测的同源建模工具SWISS－MODEL进行分析，结果如图9(见第340页)所示，可见结构中多见β折叠和无规卷曲，与二级结构预测的结果相一致。

图7 Antistasin家族保守结构域中的共有氨基酸序列Figure 7 The consensus amino acid sequences in conserved domains of Antistasin family

图8 Eisenstasin样蛋白二级结构预测结果Figure 8 The secondary structure prediction results of Eisenstasin-like protein

图9 Eisenstasin样蛋白的预测三级结构Figure 9 Predictive tertiary structure of Eisenstasin-like protein

3 讨论

Antistasin，分子量为 15 000，是 1987年 Gasic等［5］最早从墨西哥药用南美水蛭的唾液中获得的一种蛋白，可以抑制血凝与肿瘤的侵袭和转移［6，7］。Eisenstasin是Joo等［8］从安德爱胜蚓组织中发现并克隆的蛋白，可特异抑制凝血因子Ⅹa的活性。蚯蚓组织中的抗凝活性物质也多早有报道［1，2］，但对于其具体活性成分并不清楚，因此本文报道的赤子爱胜蚓组织中Eisenstasin样蛋白，具有重要的研究和应用价值。

从赤子爱胜蚓cDNA文库中获得Eisenstasin样蛋白的基因序列后，经同源比对分析，其基因和蛋白序列与Antistasin和Eisenstasin蛋白的序列同源性较高，而且还发现了Antistasin家族的保守蛋白结构域，因此推测此次从赤子爱胜蚓中发现的该蛋白质具有同Antistasin和Eisenstasin相似的抗凝血作用，也可能具有抗肿瘤侵袭的作用。

但由于本课题组尚未获得该蛋白的基因克隆，因此仅通过软件预测对其同源性和二级结构和三级结构进行了预测，二级结构预测的结果，Eisenstasin样蛋白的二级结构与Antistasin高度相似，主要以β折叠和无规卷曲的二级结构形式为主。三级结构预测结果，也可看到空间结构中的β折叠和无规卷曲为主的结构，与二级结构预测的结果是一致的。因此推测本课题组发现的Eisenstasin样蛋白应具有和Antistasin相似的功能。进一步研究该蛋白的结构和功能需要克隆该蛋白的基因序列，并构建表达克隆，表达出该蛋白质，进行功能活性实验研究。

总之，本研究为进一步Eisenstasin样蛋白结构和功能研究奠定了一定的基础。

［1］ 朱长连，王小阳，张国祯，等.蚯蚓提取物的纤溶和抗凝作用［J］.河南医科大学学报，1993，28(1):15 －17.

［2］ 韩彩芝，余素清，李秀芳，等.蚯蚓提取液纤溶及抗凝作用的实验研究［J］.中国生化药物杂志，1997，18(5):252 －254.

［3］ 何道伟，陈洪，叶银英.蚯蚓提取物体内和体外抗肿瘤作用的研究［J］.中国生化药物杂志，2005，26(6):353 －355.

［4］ 谢江碧，贺卫国，翁宁，等.蚯蚓中抗肿瘤蛋白组分的提取分离及其抗肿瘤活性［J］.中国生物化学与分子生物学报，2003，19(3):359－366.

［5］ Tuszynski GP，Gasic TB，Gasic GJ.Isolation and characterization of Antistasin.An inhibitor of metastasis and coagulation［J］.J Biol Chem，1987，262(20):9718 －9723.

［6］ Nutt E，Gasic T，Rodkey J，et al.The amino acid sequence of Antistasin.A potent inhibitor of factorⅩa reveals a repeated internal structure［J］.J Biol Chem，1988，263(21):10162 －10167.

［7］ Han JH，Law SW，Keller PM，et al.Cloning and expression of cDNA encoding Antistasin，a leech-derived protein having anti-coagulant and anti-metastatic properties［J］.Gene，1989，75(1):47 －57.

［8］ Joo SS，Won TJ，Kim JS，et al.Inhibition of coagulation activation and inflammation by a novel Factor Xa inhibitor synthesized from the earthworm Eisenia andrei［J］.Biol Pharm Bull，2009，32(2):253－258.