鸡β-防御素-13成熟肽的原核表达与抑菌活性分析

许国洋，包小玉，范 磊，刘明刚，张冬梅，周 尧，熊 涛，潘康成*

(1.四川农业大学，四川 雅安 625000；2.重庆市荣昌县畜牧局，重庆 402460)

防御素是机体内一类富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽，广泛分布于动物、植物、昆虫等体内[1-2]，是机体先天免疫系统的重要组成部分，具有广谱抗菌性，作为机体本身的一种活性物质，病原菌不易对其产生耐药性[3-4]。因其具有高效的抗菌活性和免疫增强作用，并且不会引起病原菌的耐药性等优势而成为目前生物医学方面的一个研究热点[5]。

1994年，Harrwing等最先从鸡的嗜中性粒细胞中分离提取到了β-防御素，并将其分别命名为Gal-1，Gal-1α，Gal-2[6]。目前，在 NCBI中已登录的鸡防御素共有14种，均为β-防御素[7-8]，杨玉荣等用乙酸提取的方法从鸡的肠道中分离到了Gal-13，并证明了它的抑菌活性和对雏鸡免疫功能的影响[9-10]，但提取工艺繁琐耗时，并且提取量有限。而在大肠杆菌中表达Gal-13的情况还未见报道[11]。本研究构建Gal-13成熟肽序列重组表达载体，并在大肠杆菌中大量表达，制备具有一定生物活性的重组蛋白，为进一步研究其生物特性奠定基础，也为其在畜牧业中的生产应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)、金黄色葡萄球菌和表达载体pGEX-4T-1均由重庆市畜牧科学院兽医所提供；pMD18-T载体和限制性内切酶均购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶和TRIzol试剂盒均购自Gibco公司；Prime Script RT-PCR Kit购自北京康为世纪生物科技有限公司；Gel DNA Recovery Kit购自PUEX公司；Mini Plasmid Kit购自天根生化科技(北京)有限公司；GST小鼠单克隆抗体(GST2)、碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG(完整分子)抗体、显色剂BCIP/NBT均购自Sigma公司；一站式GST标记蛋白质微量纯化套装购自北京天恩泽基因科技有限公司。30日龄广西黄鸡由重庆市畜牧科学院兽医所提供。

1.2 引物设计与合成 根据文献[7]的Gal-13 cDNA序列设计引物P1/P2和P3/P4(表1)，P1/P2用于扩增Gal-13全长序列，P3/P4用于扩增成熟肽序列。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 Gal-13基因的引物序列信息Table 1 Primers information for Gal-13 gene

1.3 基因克隆与序列分析 用液氮冷冻研磨广西黄鸡新鲜肝脏组织3次，取0.1 g，按TRIzol试剂盒说明提取总RNA。利用Prime Script RT-PCR Kit反转录合成Gal-13的cDNA序列。以P1/P2为引物，cDNA为模板，扩增Gal-13的全长序列，克隆于pMD18-T载体中，转化DH5a，挑取阳性克隆由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，将测序正确的重组质粒命名为pMD18-T-Gal-13。

测序结果经Blast比对后，采用MEGA软件中Neighbor-Joining法，将鸡、莺、雀、鼠的β-防御素核苷酸序列与所获得序列进行比对，构建系统发育进化树。

1.4 重组表达载体的构建及鉴定 以pMD18-TGal-13为模板，P3/P4为引物，扩增Gal-13成熟肽基因，反应条件：94℃ 5 min；94℃ 45 s、55℃45 s、72℃ 45 s，30个循环；72℃10 min。将PCR产物与pGEX-4T-1质粒分别用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，连接并转化感受态DH5a，对阳性克隆进行PCR和双酶切鉴定，并由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序正确的重组质粒命名为pGEX-4T-1-Gal-13。

1.5 重组蛋白的诱导表达与鉴定 将重组表达质粒转化感受态BL21，涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落至含有氨苄青霉素的LB培养液中，培养至OD600nm值为0.3～0.5时加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，30℃诱导表达4 h，进行SDS-PAGE分析。以鼠抗GST单克隆抗体为一抗，羊抗鼠IgG(HL)抗体(碱性磷酸酶标记)为二抗进行western blot鉴定。

1.6 诱导表达条件的优化

1.6.1 诱导表达的时间选择 将重组菌株接种于8支5 mL含氨苄青霉素的LB培养液试管中，30℃振荡培养，菌液OD600nm值达到0.3～0.5时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，分别在诱导表达1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h后，取样进行SDS-PAGE分析。

1.6.2 诱导剂的浓度选择 将重组菌株接种于6支5 mL含氨苄青霉素的LB培养液试管中，30℃振荡培养，至菌液OD600nm值达到0.3～0.5时，分别加入终浓度为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L的IPTG，诱导表达5 h后取样，进行SDS-PAGE鉴定。

1.7 表达产物纯化及活性鉴定 将在最适条件下诱导表达的菌液，4℃12000 r/min，离心10 min，收集沉淀，PBS重悬，在冰水浴中超声裂解(超声功率为300 W，工作4 s间歇5 s，超声裂解15 min)。取1 mL裂解液4℃下12000 r/min离心10 min，用上清液和沉淀做SDS-PAGE分析，鉴定重组蛋白是否可溶。从裂解液中纯化可溶性的重组蛋白，采用琼脂孔穴扩散法，初步分析重组蛋白的抑菌活性，分别将200 μL对数生长期的大肠杆菌BL21(DE3)和金黄色葡萄球菌涂布于LB固体培养基中，待菌液吸收后，用直径为8 mm的打孔器进行打孔，实验组每孔加250 μL的浓度为0.63 mg/mL纯化产物，3个重复，对照组为PBS，37℃孵育过夜，观察抑菌效果。

2 结 果

2.1 目的基因的扩增 采用RT-PCR从鸡的肝脏组织中扩增出Gal-13基因，约为300 bp(图1)，经测序，其与张辉华[7]等报道的序列完全一致，Gal-13基因序列的ORF片段包括180个碱基，共编码60个氨基酸，信号肽序列为前20个氨基酸，前导肽序列为4个氨基酸，成熟肽序列为36个氨基酸，以P3/P4为引物扩增出的成熟肽序列，引入了ATG片段，共124 bp(包括酶切位点与保护碱基)(图1)。

图1 Gal-13全长及成熟肽序列的扩增Fig.1 Amplification of Gal-13 full-length and mature peptide sequence by PCR

2.2 序列比对分析及进化树的构建 将所得序列进行同源性比对显示，Gal-13与广西黄鸡的Gal-13序列的同源性高达100%，与其他禽类的Gal-13同源性均达90%以上，与小家鼠(Mus musculus)和褐家鼠(Rattus norvegicus)的Gal-13同源性较低；系统进化树结果显示，所得序列与广西黄鸡Gal-13的序列聚为一簇，并且自展值较高，与鸡的Gal-10、Gal-11和Gal-l2均相距较远，进化树信息如图2所示。

2.3 重组表达质粒的构建与鉴定 对构建的重组表达质粒进行酶切和PCR鉴定表明，扩增的序列与目的片段一致，目的片段正确插入到表达质粒中。

2.4 表达产物的鉴定分析 诱导表达4 h的菌液样品经SDS-PAGE和western blot凝胶电泳分析显示，GST标签的分子量大小约为26 ku，重组蛋白的分子量大小约为31 ku，与预期结果一致，SDS-PAGE和western blot检测结果如图3所示。

2.5 诱导表达条件的优化 重组菌株各时间点的诱导表达产物电泳结果显示，加入IPTG振荡培养1 h后，可以检测到少量的重组蛋白，凝胶薄层灰度扫描结果表明，1 h～8 h的各样品中重组蛋白占菌体总蛋白的百分比分别约为16.1%、17.0%、30.0%、30.8%、37.5%、31.8%、4.0%和3.7%，重组蛋白在诱导表达5 h后达到峰值，7 h后迅速下降。重组菌株在不同浓度的IPTG 30℃诱导表达5 h后，均得到表达产物，凝胶薄层灰度扫描结果显示，表达的蛋白约占菌体总蛋白26.1%～31.8%之间，差异较小。所以，诱导剂IPTG的最适终浓度为0.2 mmol/L，最佳诱导表达时间为5 h。

图2 鸡Gal-13与部分禽及哺乳动物Gal-13基因的系统进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree based on the sequence of Gal-13,partial AvBDs and mammalian beta-defensive-13

图3 表达产物的SDS-PAGE及western blot分析Fig.3 SDS-PAGE and western blot analysis for expressed products

2.6 重组蛋白的纯化及活性分析 经分析表明裂解液的上清液和沉淀均有重组蛋白的存在，重组蛋白经试剂盒纯化后，对大肠杆菌BL21(DE3)和金黄色葡萄球菌均表现出一定的抑制作用，抑菌圈直径的平均值分别为12.54 mm和14.42 mm，对后者的抑制效果稍强于前者(图4)。

图4 抑菌活性检测结果Fig.4 The tests of antimicrobial activity

3 讨 论

Gal-13在机体天然免疫中发挥着重要作用，并且可以诱导动物的系统免疫反应，通过TLR-NFkB途径调节免疫反应，具有放大机体防御系统功能的作用，对免疫组织具有选择特异性，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁[10]。天然的Gal-13具有较好的生物活性，但不易大量获得，而化学合成难以实现其分子结构的正确构象，因此利用基因工程技术生产防御素具有现实意义[12]。

本研究采用低浓度的IPTG和低温条件来诱导重组菌株，降低了宿主菌蛋白酶的活性，减少重组蛋白的降解，防止其表达过快，形成包涵体，首次实现了Gal-13成熟肽序列在大肠杆菌中的可溶性表达[13]。同时，重组蛋白含有GST标签，便于目的蛋白的筛选、鉴定和纯化[14]。表达的重组蛋白具有一定的抑菌活性，为进一步研究其分子构象和对机体免疫力方面的影响提供了可能，同时有利于完善鸡的各种防御素的生物特性的研究，为筛选鉴定具有较好生物活性的防御素提供了实验依据。Gal-13的表达为简化抗菌肽的生产工艺和降低生产成本奠定了基础，也为深入研究抗菌肽的作用机制和开发抗感染类新药物提供了重要依据。

[1]袁雪波，郭荣富，陈恒灿，等.β-防御素的研究进展及其应用前景[J].兽药与饲料添加剂，2009，14(2)：23-25.

[2]Sugiarto H,Yu P L.Avian antimicrobial peptides:the defense role of β-defensins[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,33(2):721-727.

[3]王新卫，康相涛.禽类防御素研究进展[J].动物医学进展，2006，27(12)：35-37.

[4]Evans E W,Beach G G,Wunderlich J,et al.Isolation of antimicrobial peptides from avian heterophils[J].J Leukoc Biol,1994,56(5):66l-665.

[5]Lynn D J,Higgs R,Gaines S.Bioinformatic discovery and initial characterisation of nine novel antimicrobial peptide genes in the chicken[J].Immunogenetics,2004,56(3):170-177.

[6]Harwig S S,Swiderek K M,Kokryakov V N,et a1.Gallinacins:cysteine-rich antimicrobial peptides of chicken leukocytes[J].FEBS Lett,1994,342(3):281-285.

[7]张辉华，毕英佐，曹永长，等.胡须鸡防御素Gal-1-Gal-13基因克隆、序列分析与组织分布[J].农业生物技术学报，2008，16(4)：597-603.

[8]张祥斌，谢青梅，马静云，等.丝羽乌骨鸡β-防御素的克隆与序列分析[J].广东畜牧兽医科技，2008，33(4)：22-25.

[9]杨玉荣，佘锐萍.鸡肠道抗菌肽Gal-13的乙醇提取及其工艺优化[J].西北农林科技大学学报，2008，36(9)：22-25.

[10]杨玉荣.鸡抗菌肽Gal-13的分离提取及其对雏鸡免疫的影响和作用机理研究[D].北京：中国农业大学，2006.

[11]王璟，杨玉荣，梁红德，等.禽类防御素作用机理及基因工程研究进展[J].动物医学进展，2007，28(10)：82-84.

[12]冯兴军，王建华，单安山，等.抗菌肽基因工程研究及其表达策略[J].中国生物工程杂志，2006，26(3)：63-67.

[13]吴静，史玉颖，李玉峰，等.鸡β-防御御素-1基因在大肠杆菌中的融合表达及其初步纯化与抗菌活性测定[J].家禽科学，2013，(1)：6-11.

[14]王海英.鸡β-防御素2(Gal-2)基因在大肠杆菌中的融合表达与纯化[J].家禽科学，2008，12：7-10.