稳定表达犬瘟热病毒细胞受体SLAM的BHK-21/SLAM细胞系的建立

朱 颖，刘文鑫，赵姝静，李丹丹，冯瑜菲，关玮琨，何丽丽，江馗语，师东方*

(1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.沈阳市动物疫病防控中心，辽宁 沈阳 110161)

犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)是单股不分节的负链RNA病毒，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)，麻疹病毒属(Morbillivirus)[1]，可引起食肉目动物发病和死亡，对养犬业、毛皮动物养殖业以及野生动物保护事业造成严重危害。

CDV可通过多种细胞表面受体感染细胞，如脊髓灰质炎病毒受体-4(Nectin-4)[2]及信号淋巴细胞激活因子(SLAM)[3]等。Vero和MDCK细胞为体外分离培养CDV的常用细胞系[4]，但这两种细胞均不表达CDV的重要受体犬SLAM，研究显示CDV在这两种细胞系上存在不易适应，不产生典型细胞病变(CPE)及毒力丢失等问题，给CDV的分离培养和生物学特性研究带来不便。有学者利用脂质体转染方法构建稳定表达SLAM的细胞系，如VERO-DST细胞系、MDCK-SLAM细胞系等[5]，重组细胞系对CDV的敏感性较转染前均有不同程度的提高。但这些表达SLAM的细胞系并未商品化，如果能够构建和筛选出具有相同特性的细胞系，可以为CDV研究提供更多的候选细胞。

CDV病毒能在BHK-21细胞上增殖培养，但CPE不明显。仓鼠作为CDV的感染动物模型及仓鼠细胞系BHK-21和HmLu用于培养增殖13株Aisa 1型和Aisa 2型的CDV的报道显示，仓鼠细胞系具有增殖培养CDV的潜在应用价值[6-8]。本研究将SLAM编码基因转染入BHK-21细胞，构建稳定表达SLAM的重组细胞系，为CDV的分离、生物学特性研究和疫苗毒生产提供一种新的有效细胞系。

1 材料和方法

1.1 细胞系及病毒株 BHK-21细胞、CDV Snyder Hill株(ATCC，VR-1587)由哈尔滨兽医研究所馈赠；疫苗弱毒株CDV-11株购自齐鲁制药有限公司；1份疑似CDV感染的混合病料样品(肝、脾、肺)采自东北农业大学动物医院患病犬。

1.2 主要试剂 限制性内切酶均购自TaKaRa公司；人淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；抗HA标签单克隆抗体(MAb)、FITC标记羊抗鼠IgG(IgG-FITC)购自北京康为世纪生物科技有限公司；羊抗鼠IgG-HRP购自天根生化科技(北京)有限公司；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自东洋纺(上海)生物科技有限公司。

1.3 犬SLAM基因的克隆与重组质粒构建 参考GenBank中登录的犬SLAM基因序列(AF390108)设计引物，上游引物P1：5'-GGAGATCTGAGAGCTT GATGAATTGCCC-3'(BglⅡ)、下游引物 P2：5'-AG GTCGACTCAGCTCTCTGGGAACGTCA-3'(SalⅠ )，PCR检测BHK-21细胞不含有SLAM基因后取犬的全血，使用淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞，并提取其总RNA，以P1/P2为引物，通过RT-PCR扩增不含信号肽的犬SLAM基因，经双酶切克隆于pDisplay载体中，构建重组质粒pDisplay-SLAM。

1.4 稳定表达犬SLAM基因的细胞系建立 参照Lipofectamine 2000说明书将重组质粒pDisplay-SLAM转染BHK-21细胞。用含800 μg/mL G418的10%FBS DMEM培养基筛选，通过有限稀释法筛选单个细胞克隆。用HA MAb(1∶100)对获得的克隆细胞进行免疫荧光检测，将显示SLAM高表达的阳性细胞分别传代3次后进行SLAM mRNA的RT-PCR检测(方法同1.3)，并对阳性细胞株采用有限稀释法进一步筛选。按上述方法重复3次，最后获得稳定表达SLAM的细胞株，命名为BHK-21/SLAM。将BHK-21/SLAM细胞进行连续传代，取F5、F10、F15和F20代细胞进行RT-PCR检测，同时取F20代细胞进行免疫荧光、western blot检测以及细胞生长曲线绘制。

1.5 细胞培养物中CDV核酸载量的检测 将CDV Snyder Hill参考毒按200 TCID50分别接种于BHK-21/SLAM和BHK-21细胞，每12 h观察记录一次CPE，分别收集12 h、24 h、36 h的细胞，反复冻融3次，离心，取上清液提取总RNA，用于荧光定量PCR检测(引物：CDV-H P15'-CAAGACAAGGT GGGTGCCTT-3'，CDV-H P25'-CTTGGTGAAATCG AACTCCA-3')。构建CDV重组质粒pT-CDV-H，以其为标准品，比较BHK-21/SLAM及BHK-21细胞培养物中CDV Snyder Hill参考株的病毒核酸载量差异。

1.6 CDV流行病毒株的分离 将反复冻融处理后的病料上清液滤液进行细胞培养，逐日观察是否出现CPE，盲传5代仍不见CPE者视为阴性。如有CPE，出现约80%的CPE时收毒。分别取BHK-21/SLAM和BHK-21细胞中的第5代细胞培养物各 100 μL，进行RT-PCR鉴定。扩增引物为CDV N-P1：5'-ACAGGATTGCTGAGGACCTAT-3'和 CDV N-P2：5'-CAAGATAACCATGTACGGTGC-3'[9]。鉴定后的病毒命名为CDV-Z7。

1.7 不同病毒株在BHK-21/SLAM细胞系中生长情况的比较将200 TCID50的 CDV Snyder Hill、CDV-11和CDV-Z7分别接种BHK-21/SLAM和BHK-21细胞，加入2 mL 10%FBS DMEM培养基，并置于37℃培养，分别记录12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h的CPE比例。

2 结 果

2.1 犬SL A M基因的克隆与重组质粒构建 经RT-PCR从犬外周血淋巴细胞中扩增得到约1000 bp的预期片段(图1)。重组质粒pDisplay-SLAM经酶切鉴定，出现了预期大小的目的片段(图1)。序列结果显示，扩增的目的基因序列与GenBank登录的AF390108序列同源性为100%。试验结果证明已构建获得了阳性重组质粒pDisplay-SLAM。

图1 重组表达质粒的PCR和酶切鉴定Fig.1 Identification of recombinant expression plasmid by PCR and digestion

2.2 稳定表达犬SLAM基因细胞系的检测 以HA MAb为一抗进行免疫荧光鉴定，结果显示，BHK-21/SLAM细胞出现绿色荧光，而且阳性率接近100%(图2A)。对第5代、10代、15代和20代的BHK-21/SLAM细胞RT-PCR检测显示，SLAM基因均能稳定表达(图2C)。Western blot结果表明，表达的 SLAM 约 35 ku(图 2D)。

2.3 细胞培养物中CDV核酸载量的检测 荧光定量RT-PCR检测结果显示，CDV Snyder Hill株在BHK-21和BHK-21/SLAM细胞上均可增殖增殖，但BHK-21/SLAM细胞培养物上清中的病毒核酸含量于24 h达到最高值(107.9拷贝 /μL)，较相同时间BHK-21细胞培养物上清滤液中的核酸含量显著提高(106.28拷贝 /μL)(图 3)。

图2 稳定表达SLAM蛋白BHK-21/SLAM细胞的鉴定Fig.2 Identification of the BHK-21/SLAM cells line stably expressing SLAM protein

图3 细胞培养物在不同时间的核酸含量Fig.3 Nucleic acid content in cell cultures at different times

2.4 CDV流行病毒株的分离 将临床病料样品处理后分别接种于BHK-21/SLAM和BHK-21细胞，连续传代，结果显示从第5代开始在BHK-21/SLAM细胞出现明显的CPE，传至第10代仍能出现CPE，而BHK-21细胞未出现CPE。通过RT-PCR检测和病毒纯化获得一株CDV野毒株，命名为CDV-Z7。

2.5 不同病毒株在BHK-21/SLAM和BHK-21细胞上生长情况比较 CDV Snyder Hill株、CDV-11株和CDV-Z7株分别接种BHK-21/SLAM及BHK-21细胞后 12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h。结果显示，BHK-21细胞各时间点均未出现CPE，BHK-21/SLAM细胞在接种后12 h出现CPE，24 h后病变率约为 100%(表 1)。

表1 3株CDV感染BHK-21/SLAM和BHK-21细胞的CPETable 1 The CPE of BHK-21/SLAM cells and BHK-21 cells after infection of three CDV strains

3 讨 论

稳定、敏感的细胞系是对病毒进行体外研究的前提和基础，其对病毒的分离获得和生物学特性研究具有重要意义。本实验室在前期研究中曾用MDCK细胞进行了弱毒疫苗株CDV-11株的培养和野毒株CDV-J7株的分离。CDV-11株在MDCK细胞中可传代无CPE，野毒株CDV-J7在MDCK细胞上初次分离时出现典型的细胞融合、脱落等明显CPE，但继续传代则CPE逐渐不明显，并且CPE出现的时间推迟，细胞培养物中CDV滴度不高，导致采用电镜难以观察到病毒粒子。因此，本实验选择具有培养增殖CDV能力而不表达SLAM受体的BHK-21细胞，构建稳定表达SLAM的重组细胞系。

本研究将CDV Snyder Hill株接种BHK-21/SLAM及BHK-21细胞，12 h后BHK-21/SLAM细胞即出现CPE，而BHK-21细胞盲传5代仍无CPE。荧光定量RT-PCR结果表明24 h时BHK-21细胞培养物上清液中CDV核酸含量较BHK-21细胞显著提高(分别为 107.9拷贝 /μL 和 106.28拷贝 /μL)。在分离CDV野毒株方面，不同的细胞系出现CPE的时间不同，Vero.DogSLAMtag细胞在24 h出现CPE[10]；A-72/cSLAM和CRFK/cSLAM细胞在48 h产生明显的CPE[5]；BHK-21/SLAM细胞，在盲传5代后出现CPE。虽然出现CPE的时间与细胞表达SLAM的能力有关，但不同病毒株H蛋白氨基酸的差异也影响病毒对细胞的嗜性[4]，本试验病毒适应后感染BHK-21/SLAM细胞12 h即出现CPE。研究结果显示，重组细胞系BHK-21/SLAM在CPE形成和病毒增殖能力方面均有明显提高，本实验为CDV的研究提供了敏感的细胞系。

[1]Appel M J.Pathogenesis of canine distemper[J].Am J Vet Res,1969,30(7):1167-1182.

[2]Pratakpiriya W,Seki F,Otsuki N,et al.Nectin4 is an epithelial cell receptor for canine distemper virus and involved in the neurovirulence[J].J Virol,2012,86(18):10207-10210.

[3]Tatsuo H,Ono N.SLAM(CDw150)is a cellular receptor for measles virus[J].Nature,2000,406(6798):893-897.

[4]Lednicky J A,Meehan T P,Kinsel M J,et al.Effective primary isolation of wild-type canine distemper virus in MDCK,MV1 Lu and Vero cells without nucleotide sequence changes within the entire haemagglutinin protein gene and in subgenomic sections of the fusion and phospho protein genes[J].J Virol Methods,2004,118(2):147-157.

[5]Nakano H,Kameo Y,Andoh K,et al.Establishment of canine and feline cells expressing canine signaling lymphocyte activation molecule for canine distemper virus study[J].Vet Microbiol,2009,133(1):179-183.

[6]Bencsik A,Malcus C,Akaoka H,et al.Selective induction of cytokines in mouse brain infected with canine distemper virus:structural,cellular and temporal expression[J].J Neuro immunol,1996,65(1):1-9.

[7]Cosby S L,Lyons C,Fitzgerald S P,et al.The isolation of large and small plaque canine distemper viruses which differ in their neurovirulence for hamsters[J].J Gen Virol,1981,52:345-353.

[8]Serageldeen S,Nguyen L,Toshiki U,et al.Propagation of Asian isolates of canine distemper virus(CDV)in hamster cell lines[J].Act Vet Sci,2009,51.

[9]许红丽，易立，王建科，等.荧光定量RT-PCR法对犬瘟热病毒PS株感染犬血清和粪便中病毒的检测[J].中国预防兽医学报，2012，34(1)：49-52.

[10]Seki F,Ono N,Yamaguchi R,et al.Efficient isolation of wild strains of canine distemper virus in Vero cells expressing canine SLAM(CD150)and their adaptability to marmoset B95a cells[J].J Virol,2003,77(18):9943-9950.