不同浓度的胎牛血清对骨髓间充质干细胞纯度及周期的影响

陈小丹，何家才

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是成熟体细胞的亚群，又称为基质干细胞，是治疗中应用间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的基础。MSCs具有黏附能力并且能够在体外扩增;多分化潜能:在特定的生理或是实验条件下能分化为特定的功能细胞、组织、器官，同时免疫抑制的能力［1］;这些特点使其成为组织工程再生医学中理想的种子细胞［2］。然而BMSCs的含量极低，因此很难在短期内获得大量的BMSCs。分离扩增大量的原始干细胞成为研究和应用干细胞的先决条件。但其增殖和生长受很多因素影响，因此找到一个既简单又可行的方法是在短期内获得大量BMSCs的重要问题。目前，体外培养BMSCs的完全培养液中大部分都加 FBS，而文献［3－6］报道中关于BMSCs体外培养的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的浓度不尽一致。不同浓度的FBS对其生物学特性研究较少，该文探讨3种不同浓度的FBS对BMSCs的纯度及细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康SD大鼠15只，4周龄，普通级，体重75～100 g，由安徽医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂及仪器 L－DMEM培养基、FBS、胰蛋白酶(澳洲 Hyclone公司);荧光标记抗大鼠CD29－PE、CD45－PE(美国 Biolegend 公司);CD44－FITC、CD90－FITC(美 国 Santa Cruz 公 司);Axiovert200倒置相差显微镜(德国Zelss公司);流式细胞仪(美国BD公司);超净工作台(中国苏州净化公司)、CO2细胞培养箱(美国Thermo公司);冷冻离心机(美国Beckman公司);酶联免疫检测仪(美国BioTek公司);CCK－8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(上海贝博生物试剂公司);细胞周期检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分离、培养 以颈椎脱臼法处死大鼠，置于体积分数为75%乙醇溶液中消毒5～7 min，在超净台中取出股骨和胫骨，然后放到另一杯乙醇溶液内消毒5～6 s后用PBS洗3遍，再置于PBS内。用注射器抽吸完全培养基反复冲洗骨髓腔，直至股骨和胫骨两端发白，然后按细胞浓度1×109/L将细胞悬液加入至培养瓶内，随后将培养瓶置于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。2 d后首次半量换液，以后每3 d全量换液1次，每次换液去除悬浮的杂细胞。

1.2.2 BMSCs的传代培养 当细胞生长至80% ～90%融合时，用PBS洗细胞2～3次，然后加入胰蛋白酶1 ml消化 1.5～2.0 min，在镜下见间隙增宽，细胞变圆，有少量细胞悬浮时立刻加含体积分数为0.10 FBS的完全培养基终止消化。然后制备成细胞悬液，离心，去上清液，以相应的培养基重悬细胞后并按1×107/L传代，记为第1代(P1)，以此类推第2、3、4、5 代记为 P2、P3、P4、P5。传代时严格控制胰酶的时间，将淋巴细胞、单核细胞等去除。

1.2.3 BMSCs的鉴定 实验分为A、B、C 3组分别为用 0.10、0.15、0.20 的完全培养基培养的 BMSCs，取A、B、C原代第72小时和第9天的细胞，在倒置显微镜下观察细胞的生长情况并拍照记录细胞形态。

1.2.4 流式细胞仪检测 BMSCs表面标志 取A、B、C 3组原代细胞，2 d后首次半量换液，以后2～3 d全量换液1次，当细胞长至80% ～90%融合时，用0.25%的胰酶消化传代记为P1，然后依次传代下去记为P2、P3、P4、P5。用PBS洗洗涤这3种培养基培养的2、3、4、5 代细胞2 ～3 次，弃上清液，余 100 μl，配成终浓度为1×106/ml的细胞悬液。分别加入CD29－PE、CD45－PE(1.25 μl)，CD44－FITC、CD90－FITC(20 μl)，及同型对照，4 ℃避光孵育 30 min，之后再用PBS洗细胞2～3次，弃上清液，加入500 μl PBS，制备成单细胞悬液，上流式细胞仪，检测PE、FITC标记的细胞占细胞总数的百分比进行表面抗原测定。

1.2.5 不同浓度的FBS对BMSCs细胞周期的影响取生长转态良好的P3细胞，用PBS洗细胞2次，然后用0.25%的胰酶消化1.5～2.0 min，按细胞浓度为1.0×109/L传代至12个一次性细胞培养瓶，每4瓶分为一组，随机分为3组，3～5 h后细胞铁贴壁，弃去原培养液，分别加入含体积分数为0.10、0.15、0.20 的 FBS 的 L－DMEM 培养液，在 5%CO2、37℃培养箱内孵育，分别将相应培养基孵育24、48、72、96 h的BMSCs用PBS洗洗涤细胞2～3次，70%乙醇固定过夜，次日PBS冲洗去乙醇，加入100 μl RnaseA，混匀，37 ℃水浴 30 min，然后加入 40 μl PI染液，4℃避光30 min，然后上机检测相应培养基孵育后的 24、48、72、96 h 的 BMSCs的周期。

1.2.6 不同浓度的FBS对BMSCs活力的影响 收集P3 BMSCs，调整细胞数制备细胞悬液，以密度为5×104/ml接种于6个96孔板中，每孔加FBS体积分数是 0.10、0.15、0.20 的完全培养基制备的细胞悬液100 μl，置5%CO2、37 ℃ 培养箱内孵育。于第1、2、3、4、5、6 天各取1 块板，每孔加 10 μl CCK－8 溶液，37℃孵育3 h，用酶联免疫检测仪测定波长为450 nm时各孔的吸光度值(optical density，OD)。

1.3 统计学处理 应用SPSS 16.0统计软件分析，数据以±s表示，采用单因素方差及t检验分析多组间的差异。

2 结果

2.1 流式细胞术检测BMSCs表面标志 BMSCs经流式细胞仪检测结果显示，单标时CD29阳性率97.77%，CD90 阳 性 率 98.04%，CD44 阳 性 率99.38%，CD45阳率 1.96%;双标结果进一步显示BMSCs高表达 CD29、CD90、CD44，低表达 CD45，见图1。取分别用含体积分数为 0.10、0.15、0.20 3 种完全培养基培养的P2～P5 BMSCs进行流式细胞术进行分析，A、B、C 3组细胞表面标志物在P3、P4均能获得较纯的BMSCs，其表达率依次为:CD45平均表 达 率 为 4.29%、3.28%、1.80%;CD29 为93.23%、95.43%、93.94;CD44 为 91.27%，95.31%、94.92;CD90 为 95.55%、95.66%、95.05%，见表 1。

2.2 BMSCs的形态学观察 原代培养:用3种含不同体积分数的完全培养基培养的BMSCs在刚接种到各自的培养瓶时，细胞呈大小不一的圆形，悬浮于培养液内。72 h后半量换液去除没有贴壁的细胞，此时可见到多数细胞贴壁，呈圆形、类圆形，多角形，少数细胞伸展成长梭形，A、B、C 3组的贴壁细胞数依次增加，见图2a、b、c。以后每2 d全量换液，不断地去除杂细胞。到第9天时，细胞已铺满瓶底，呈现形态均一的长梭形，排列成漩涡状，鱼群状，A、B、C 3组均已铺满瓶底，C组密度最大，其次B组，A组相对 B、C 两组较疏，见图2d、e、f。

表1 3种不同浓度的胎牛血清中第2、3、4、5代BMSCs免疫表型流式检测结果

图1 流式细胞术检测细胞(P3)表面标志结果

图2 BMSCs的形态学观察图 ×100a、b、c:A、B、C 3 组 BMSCs培养后 72 h;d、e、f:A、B、C 3 组 BMSCs第9天

2.3 流式细胞仪检测BMSCs周期变化 表2显示，3种完全培养基中的BMSCs的G0/G1期随浓度的增加而降低，但差异无统计学意义，同一浓度随时间的延长也是降低;G2/M期在24 h后0.10与0.15组无差异，0.15 与 0.20 和 0.10 与 0.20 组有差异(F=12.412，P ＜0.05)，但随时间的延长无差异。24、48、72、96 h 4个时间点 S期的结果在3种完全培养基中差异无统计学意义，S+G2/M期在4个时间点随浓度的增加而增加。3种完全培养基培养24、48、72、96 h 的 BMSCs的细胞周期见图3。

2.4 随着时间变化3种不同浓度培养基中的BMSCs的活力情况 在接种到96孔板的第1天A、B、C 3组的OD值依次增大，三者之间差异有统计学意义(P ＜0.05，F=5.002)，随着时间的延长三者的OD值无明显差异，见图4。

3 讨论

MSCs存在于许多组织器官内，首次是在骨髓内被鉴定出来，主要特点是体外培养时具有黏附、自我更新能力，保持未分化特点，分化为成骨、成软骨和脂肪细胞［7］，这是MSCs最基本的功能，此外还可以向管状上皮细胞［8］，肝细胞等［9］分化，因具有以上功能因此被广泛的应用于组织工程、基因治疗、细胞治疗，被用来运送生物制剂和检测新植入材料的生物相容性。

图3 流式细胞术检测3种完全培养基中24、48、72、96 h的BMSCs的细胞周期

表2 细胞周期结果(n=4，%，±s)

表2 细胞周期结果(n=4，%，±s)

与体积分数(0.20)比较:*P ＜0.05

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图4 3种培养基中的BMSCs在培养 1、2、3、4、5、6 d 的活力变化情况

目前分离BMSCs的方法有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、免疫磁珠法、骨髓过滤装置［10］，后3种方法易损伤细胞活性，过程繁杂，前2种方法培养的细胞在前2代有差别，但至P3均已无差异。因此该文选取简单易行且能够获得足够数量与纯度的第一种方法。

至目前，对BMSCs的鉴定尚没有统一的方案。一般是通过以下方法来鉴定:首先，黏附能力;其次:多分化潜能;最后:表面标志，BMSCs无特异性表面标志，因属于非造血干细胞所以不表达 CD11、CD14、CD34 和 CD45，高 表 达 CD29［11］、CD44、CD73、CD271［12］、CD90、STRO－1 和 CD1 偶05/SH2。因为抗大鼠的抗体非常少，因此本文选择CD45－PE、CD29－PE、CD44－FITC、CD90－FITC 做为鉴定干细胞的标志。本文实验结果显示，CD45呈低表达而CD44、CD90、CD29高表达。细胞周期结果显示，P3细胞85%以上处于G0/G1期，说明是干细胞。

FBS含有BMSCs生长和增殖所需要的物质如生长因子:TGF－β1、β3、FGF－2 等，因此都要在基础培养液里加FBS［13］，但是关于适宜浓度，不同的文献报道不尽一致。有的实验结果显示11%FBS的完全培养基最适合BMSCs的增殖［3］，有的研究结果显示 15%［4］、20%［5］的完全培养基中 BMSCs 显示出最高的增殖能力，还有报道10% ～20%有利于BMSCs的增殖，传统的培养基是DMEM加10%的FBS。本实验结果与传统的结论一致，10%的完全培养基已经适合BMSCs的体外扩增培养。不同的结果也许是由于每1批次的FBS不同，枪头准确性，或是BMSCs培养传代的过程中胰酶消化时间，传代方法不同等原因，这些都会影响其相关特性和分化的能力，进行实验前建议进行FBS批次的检测。

细胞周期包括间期和分裂期2个阶段，间期包括G0/G1期、S期、G2/M期，在此期间进行着复杂的物质合成和能量储备。不同浓度FBS对BMSCs周期的影响是不同的，主要发生在间期内。该实验结果显示随着时间的增加，3种完全培养基G0/G1期减少，S期+G2/M期减低，均能促进BMSCs的增殖，3期中只有G2/M期在24 h时3组之间差异有统计学意义，3组的G0/G1期、S期、G2/M期在其余各个时间点差异均无统计学意义。

FBS内含有营养物质和生长因子，浓度的不同会影响BMSCs的增殖、分化、基因表达、稳定性和活力。OD值可以间接反应细胞的活力。不同浓度的FBS对BMSCs活力的影响在第1天有差异，但在以后的5 d 3组活力相当，没有差异，说明含体积分数为0.10 FBS的完全培养基已满足BMSCs的活力，与细胞周期结果吻合。

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