应用基因芯片技术筛选转染CDX2基因后胃癌细胞差异表达基因

陈晓双，秦 蓉，储 婧，陈宗科

胃癌是源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，发病率居我国恶性肿瘤首位。CDX2尾型同源盒转录因子2，位于人类13号染色体，属于ParaHox cluster成员。目前国内外普遍认为CDX2在肠黏膜上皮细胞的发育及其形态和结构特征的维持过程扮演重要的作用。前期研究［1］显示CDX2在正常胃黏膜组织、慢性浅表性胃炎中不表达，在肠化组织中的表达明显高于异型增生和胃癌，在胃癌细胞中CDX2过表达明显抑制胃癌细胞增殖、降低其迁移能力。该文将CDX2基因和空载体分别转染至胃癌细胞系BGC-823中，构建实验组BGC-823/CDX2和阴性对照组BGC-823/EV，利用基因芯片技术筛选CDX2转染人胃癌细胞BGC-823后差异表达基因;应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction，Real-time PCR)技术对基因芯片结果进行验证分析，从而确认基因芯片结果准确性。通过寻找受CDX2调控的下游基因，进一步探讨CDX2基因在胃癌细胞作用的可能分子机制，为下一步的功能研究提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料 真核表达质粒pEGFP-C1-CDX2、空载体pEGFP-C1和人胃癌细胞系BGC-823细胞由本实验室长期保存。DMEM培养液购于美国Hyclone公司;胎牛血清购于杭州四季青公司;胰酶购于碧云天生物公司;总RNA提取试剂TRIzol购于美国 Invitrogen公司;基因芯片为Affymetrix Human Genome U133 2.0 Array，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit由加拿大 Fermentas公司提供;Attractene Transfection Reagent、QuantiFast SYBR Green PCR Kit、QuantiFastPrimerAssay(DKK3、FOXP1、TWIST1、GATA6、RUNX3、BMP2 和 β-actin)均由德国QIAGEN公司提供。

1.2 方法

1.2.1 BGC-823细胞转染与筛选 在35 mm培养皿中常规培养BGC-823细胞，取处于对数生长期细胞用胰酶消化，重悬，以2×105/孔的密度接种于6孔板中，以转染试剂Attractene Transfection Reagent分别介导1.2 μg重组质粒pEGFP-C1-CDX2和阴性对照空载体pEGFP-C1转染BGC-823细胞。细胞转染9 h后换液，转染24 h后，按照1∶4传代，接种于24孔板中，待细胞贴壁后用G418进行抗性克隆筛选，G418 起初计量为 400 μg/ml，培养 8 h 后，递减为200 μg/ml，维持此浓度，直至获得稳定的细胞株，并分别命名为BGC-823/CDX2和BGC-823/EV。

1.2.2 逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)检测 CDX2 基因mRNA表达 在35 mm培养皿中常规培养BGC-823/CDX2、BGC-823/EV和BGC-823 3组细胞，按照TRIzol说明书提取总 RNA。应用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit将总RNA逆转录为cDNA。CDX2和内参照GADPH由英骏生物技术有限公司合成。CDX2上、下游引物分别为5'-ATCATCGAATTCTGCCACCATGTACGTGAGCTACCTCCTGGA CAAG-3'和5'-ATCATCGGATCCTCACTGGGTGACGGTGGGGTTTAGCA-3'，产物大小 961 bp;内参照GADPH上、下游引物分别为5'-AACGGATTTGGTCGTATTG-3'和 5'-CTGGAAGATGGTGATGGG-3'，产物大小210 bp。取3 μl cDNA按常规操作进行PCR扩增，并使用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.3 总RNA提取及纯化 在35 mm培养皿中常规培养BGC-823/CDX2和BGC-823/EV两组细胞，48 h后收获细胞，按照 TRIzol说明书提取总RNA，采用紫外分光光度计Nanodrop-1000测定样本吸光度，经RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司，德国)纯化样本并采用凝胶电泳系统Agilent-2100进行检测。Agilent结果显示实验组与对照组28S和18S RNA比值符合芯片检测要求。

1.2.4 制备cDNA和 cRNA 对两组样本总 RNA分别进行以下操作:应用Affymetrix One-cycle cDNA Synthesis Kit将总RNA依次合成1 st cDNA及2 nd cDNA，合成双链cDNA经Affymetrix Genechip Sample Cleanup Module纯化。纯化后的cDNA经Affymetrix GeneChip IVT Labeling Kit转录合成生物素标记cRNA，并应用 Genechip Sample Cleanup Module进行纯化。取15 μg纯化后的 cRNA，加8 μl 5×Fragmentation Buffer 和 40 μl RNase-Free Water，混匀，94℃温浴35 min，反应结束后置于冰上使cRNA片断化，产生的cRNA片段大小为35～200 bp，可用于芯片杂交。

1.2.5 芯片杂交、洗脱和染色 实验选用的芯片为Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，该芯片包含人类全基因组47 000个转录本，38 500个明晰的人类基因。取适量片断化cRNA与芯片进行杂交，45 ℃，60 r/min，16 h。杂交完毕后，从芯片中吸出杂交液，应用Fluidics Station 450进行芯片洗脱和染色。

1.2.6 芯片扫描及数据采集 使用Affymetrix GeneChip Scanner 3000对芯片进行扫描，并采用Affymetrix GeneChip Operating Software(GCOS)Version 1.4软件对扫描图像进行数据分析，根据Ratio值筛选出差异表达基因，并对差异表达基因进行Gene Ontology富集分析(参考网站http://www.geneontology.org)。

1.2.7 Real-time PCR验证芯片结果 按照TRIzol说明书分别提取BGC-823/CDX2和BGC-823/EV两组细胞总RNA。应用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit将总 RNA逆转录为 cDNA。使用QuantiFast SYBR Green PCR Kit进行Real-time PCR。DKK3、FOXP1、TWIST1、GATA6、RUNX3、BMP2以及内参照β-actin引物均由QIAGEN公司合成。GATA6引物:QT01001133，产物大小 76 bp;RUNX3引物:QT00040306，产物大小69 bp;BMP2引物:QT00012544，产物大小148 bp;DKK3引物:QT00036057，产物大小 173bp;FOXP1引物:QT00064890，产物大小 96bp;TWIST1引物:QT00011956，产物大小127 bp;内参照β-actin引物:01680476，产物大小104 bp。Real-time PCR反应体系为:95℃，5 min;95℃，10 s;60℃，30 s;重复40个循环;溶解曲线温度范围:60～95℃。所有样本做3个复孔。获得样本Ct值，以β-actin作为内参照，根据相对定量法2－ΔΔCt计算差异倍数。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件分析，数据以±s表示，组间比较采用两样本t检验。

2 结果

2.1RT-PCR检测CDX2基因mRNA表达 RTPCR产物经琼脂糖凝胶电泳后显示，BGC-823/CDX2在961 bp位置可观测到一条清晰的特异性条带，而空白对照组BGC-823和阴性对照组BGC-823/EV在该位置未出现此条带，表明稳定转染细胞株BGC-823/CDX2确有CDX2 mRNA的转录。见图1。

图1 RT-PCR检测人胃癌BGC-823细胞CDX2 mRNA表达M:Marker;1:BGC-823空白对照组;2:BGC-823/EV阴性对照组;3:BGC-823/CDX2转染组

2.2 基因芯片 经基因芯片筛选CDX2过表达胃癌细胞差异表达基因599个，其中上调基因275个，下调基因324个。对芯片结果进行功能分类，发现差异基因涉及细胞增殖、分化、凋亡和信号转导、蛋白酶活性、肿瘤侵袭和转移等方面。部分差异表达基因见表 1、2。

2.3 Real-time PCR验证分析差异表达基因 根据差异表达基因涉及的不同功能，选择6个差异表达基因进行Real-time PCR。其结果显示，与BGC-823/EV比较，DKK3、FOXP1和 TWIST1在 BGC-823/CDX2中表达上调(t=12.100，t=27.845，t=14.072;P ＜0.05)，见图2;GATA6、RUNX3和 BMP2在BGC-823/CDX2中表达下调(t=－5.548，t=－4.643，t= －3.930;P ＜0.05)，见图 3。Real-time PCR结果与芯片结果一致，说明芯片结果可靠。

图2 DKK3、FOXP1和TWIST1在BGC-823/EV和BGC-823/CDX2两组细胞中的相对表达水平与BGC-823/EV组比较:*P＜0.05

图3 GATA6、RUNX3和BMP2在BGC-823/EV和BGC-823/CDX2两组细胞中的相对表达水平与BGC-823/EV组比较:*P＜0.05

表1 部分表达显著增强的基因

表2 部分表达显著减弱的基因

3 讨论

基因芯片技术的产生和发展与分子生物学、人类基因组计划密不可分，基因芯片拥有高度并行性、高通量、微型化等显著特点。目前，基因表达谱芯片可用于检测肿瘤相关基因表达、进行肿瘤分类和筛选抗肿瘤药物等，是消化道肿瘤分子水平研究的重要工具。

CDX2基因在人胃癌细胞系BGC-823细胞中低表达，该研究建立在CDX2过表达胃癌细胞系基础上，利用人类表达谱芯片对该细胞系的表达谱进行初步研究。基因芯片筛选出表达差异基因共599个，其中上调基因275个，下调基因324个。这些差异表达基因在细胞增殖、分化、凋亡，细胞黏附及细胞周期等细胞生理过程中发挥重要调控作用，参与肿瘤细胞的信号转导、侵袭和转移等过程。

表达上调基因中，DDR2、GAS1、FAS、DKK3、TWIST1等与细胞增殖、分化、凋亡，肿瘤侵袭转移有密切联系。DDR2作为受体型酪氨酸激酶通过纤维性胶原被激活，Kawai et al［2］通过建立 ATDC5 细胞系和miDdr2-transfected ATDC5细胞系小鼠模型探究DDR2在软骨细胞增殖中的作用，推断DDR2可能负性调节细胞增殖。GAS1经内在凋亡途径诱导细胞死亡，可通过调节 BCL-2/Bax比值和激活caspase-3诱导胃癌细胞凋亡［3－4］。死亡受体 FAS是肿瘤坏死因子受体家族重要成员，经FAS/FASL通路转导死亡信号诱导细胞凋亡［5］。DKK3是Wnt复合物受体拮抗剂，在各种类型肿瘤中表达下调，经Wnt/β-catenin 信号通路抑制肿瘤［6］。TWIST1 是碱性螺旋-环-螺旋蛋白家族中的高度保守的转录因子，可诱导上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)以及促进细胞外基质的降解［7］，在胃癌发生发展和侵袭转移中扮演重要作用［8］。

表 达 下 调 基 因 中 PAK1、BDNF、CLDN7、RUNX3、BMP2等参与细胞增殖、分化、凋亡，及肿瘤侵袭转移过程。PAK1是典型的进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，是小分子 GTPases Rho、Rac1和Cdc42的重要效应分子。在胃肿瘤转移的研究中发现PAK1过表达时肿瘤细胞形成张力纤维和黏着斑复合物的能力减弱从而影响细胞骨架重构促进细胞迁移［9］。BDNF与它的主要受体TrkB结合后，使MMP-1表达上调，MMP-1激活肽链内切酶降解肿瘤微环境中ECM蛋白从而促进人类软骨肉瘤细胞迁移，许多肿瘤组织中 BDNF和 TrkB表达上调［10］。CLDN7属于黏附连接蛋白家族成员，主要表达在弥漫型胃癌，可成为胃肿瘤预后标志物［11］。在正常的胃黏膜上皮细胞中，转录因子RUNX3经TGF-β信号通路调节细胞增殖和凋亡，RUNX3对胃黏膜上皮细胞起到保护性作用［12］。骨形成蛋白BMP2属于TGF-β超家族，在胃癌侵袭和转移中，BMP2信号通路是通过招募PI3K/AKT和 MAPK通路，从而激活NF-κB 通路，使 MMP-9 激活和肿瘤细胞转移［13］。

与其他研究方法相比，应用基因芯片技术可以快速高效地获取CDX2过表达BGC-823细胞的基因表达谱，及大量差异表达基因的信息，从而预测这些基因的功能和基因间的相互关系，以及与CDX2基因的调控关系。然而芯片结果主要反应基因在转录水平的变化，具有一定的局限性。

本研究应用人类表达谱芯片成功筛选出CDX2转染人胃癌细胞系BGC-823细胞后差异表达基因，Real-time PCR验证芯片结果可靠。随后的基因功能分析中获取了许多CDX2可能作用的候选基因，这些基因都可能是CDX2在胃癌组织发生作用的靶点，为深入探讨CDX2在胃癌中的作用机制提供了线索。

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