动态浊度法测定醒脑静注射液的细菌内毒素含量

汤秋华 林 辉 张一帆 黄祥昌

（福建医科大学附属泉州第一医院，福建 泉州 362000）

动态浊度法测定醒脑静注射液的细菌内毒素含量

汤秋华 林 辉 张一帆 黄祥昌

（福建医科大学附属泉州第一医院，福建 泉州 362000）

目的建立醒脑静注射液中细菌内毒素含量测定方法。方法采用《中国药典》2010年版二部附录中细菌内毒素的动态浊度法。结果将醒脑静注射液稀释80倍，用细菌内毒素定量法检测无干扰因素影响，其平均回收率均在50%～200%。结论该法快捷、准确、灵敏，可用于醒脑静注射液中细菌内毒素的检测。

醒脑静注射液；细菌内毒素；动态浊度法鲎试验

醒脑静注射液是由麝香、冰片、栀子、郁金四味中药提取精制而成的中药制剂，能够透过血脑屏障，直接作用于中枢神经系统，能有效降低血脑屏障通透性，起到调节中枢神经，保护大脑、减轻脑水肿和改善微循环等作用，具有清热泻火，凉血解毒，开窍醒脑功效。临床用于治疗脑血管意外、乙型脑炎、肺性脑病、心绞痛等疗效较好，且疗效确切[1]。现国家标准中规定了热原检查项[2]，注射剂量为2 mL/kg。现有文献仅有用凝胶法检测醒脑静注射液中细菌内毒素的研究报道[3]，但未见采用动态浊度法对其进行细菌内毒素的检测，本文根据中国药典2010版药典中细菌内毒素检查法研究的指导原则要求，探讨了动态浊度法定量检测醒脑静注射液细菌内毒素的可行性，结果满意。

1 材 料

BET-48G细菌内毒素测定仪（天津市天大天发科技有限公司）；ZH-2型自动旋涡混合器（天津药典标准仪器厂）；定量鲎试剂（TAL，批号120813，检测限0.01～10 EU/mL，规格0.5毫升/支，厦门市鲎试剂实验厂有限公司）；细菌内毒素检查用水（BET，批号110801，规格10毫升/支，内毒素含量＜0.005 Eu/mL，厦门市鲎试剂实验厂有限公司）；细菌内毒素工作标准品（批号150601-201175，规格150毫升/支，中国药品生物制品检定所）；醒脑静注射液（河南天地药业股份有限公司，批号：20130427、20130721、20130830，规格：10毫升/支）；所有玻璃器皿经250 ℃至少2 h除去外源性热原。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值（L）的确定[4]：L=K/M，K为规定的给药途径，即人每千克体质量每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂为5.0 EU/（kg·h）；M为人用每千克体质量每小时的最大供试品剂量，醒脑静注射液成人一次最大用量为20 mL，取人体平均体质量为60 kg计算，所以M为20/（60×1）=0.33 mL/（kg·h），计算得样品的细菌内毒素限值L为15 EU/mL。

2.2 标准曲线制备及可靠性实验[4]：取细菌内毒素工作标准品一支，加BET水1 mL溶解，旋涡混合器上混合15 min后，用BET水对其逐级稀释，使其最终浓度分别为2.0、0.5、0.125、0.03125 Eu/mL，每一步稀释都在旋涡混合器上混合30 s，每一浓度取0.1 mL分别加到预先加有0.1 mL鲎试剂反应管内，混合均匀，立即插入到已设置好实验程序的BET-48G细菌内毒素测定仪进行自动检测，每一浓度重复3管；另取0.1 mL BET水加到预先加有0.1 mL鲎试剂反应管内做阴性对照，平行做2管。以反应时间T的对数与内毒素浓度C的对数作线性回归，得标准曲线为：LgT=3.15299+（-0.38122LgC），|r|=0.9937＞0.980，标准曲线最低内毒素浓度点λ=0.03125 Eu/mL，阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，故标准曲线成立。

2.3 预干扰试验

2.3.1 最大有效稀释倍数（MVD）的计算[4]：按公式MVD=L× C/λ，L为醒脑静注射液内毒素限值15 Eu/mL，c=1.0 mL/mL，λ=0.03125 Eu/mL，计算得透析液MVD为480倍。

2.3.2 样品溶液配制及预干扰试验：将醒脑静注射液用BET水稀释为20、40、80倍，记为Ai；同时另取3管进行同样倍数的稀释，但在稀释液中添加浓度为0.5 Eu/mL的细菌内毒素溶液，作为样品添加内毒素阳性对照管，记为Bi。分别取上述各液0.1 mL加到预先加有0.1 mL鲎试剂反应管内，混合均匀，立即插入到已设置好实验程序的BET-48G细菌内毒素测定仪进行自动检测，每一浓度重复2管，计算回收率（%）=（Bi液内毒素值-Ai液内毒素值）/0.5×100%，结果见表1。

表1 预干扰试验结果

由表1可见，样品添加内毒素平均回收率均在50%-200%范围内，符合《中国药典》2010年版二部规定，表明醒脑静注射液在稀释倍数为80以内对试验均无干扰。经分析比较，选择无干扰且回收率接近100%的80倍稀释进行测定。

2.4 干扰试验的验证：为确证醒脑静注射液80倍稀释的有效性，进行3个批号醒脑静注射液正式干扰试验。按“2.3”项下方法，对3个批号醒脑静注射液稀释80倍进行干扰试验，每个浓度重复2管，计算回收率，结果见表2。

表2 于扰试验的验证结果

由表2可见，将样品稀释80倍，样品回收率均在有效范围50%～200%范围内，符合《中国药典》2010年版细菌内毒素检查法的有关规定，表明在该稀释倍数下样品对实验无干扰，在这一浓度下测得的内毒素数值真实、有效，检测醒脑静注射液时选用稀释倍数为80倍稀释液即可。

3 讨 论

3.1 本文通过建立定量检测醒脑静注射液中细菌内毒素的试验方法，对完善该品种质量标准提供参考。经过方法学试验考察，动态浊度法测定其内毒素含量的方法快速、准确、可靠。

3.2 试验结果表明，用动态浊度法检测醒脑静注射液中细菌内毒素含量，当稀释80倍时，其回收率可达到50%～200%，表明在该浓度下样品对试验结果无干扰，可用于醒脑静注射液内毒素的定量检测。

3.3 动态浊度法检测范围宽，灵敏度高，可对样品中细菌内毒素进行定量检测，反应样品受内毒素污染的程度有着不同于凝胶法检测的优势，克服了凝胶法主观人为判断等因素的影响，且通过与凝胶法验证对比，结果一致。

[1] 宋燕熙,焦亿.醒脑静注射液临床应用概述[J].中国中医药科技,2010,17(5):472.

[2] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准[S].中药成方制剂第十七册.WS3-B-3353-98.

[3] 王梅娟,谢斌.醒脑静注射液细菌内毒素检测方法的建立[J].中国医药导报,2008,5(34):12.

[4] 中国药典.二部[S].北京:中国医药科技出版社, 2010:附录99-102.

Determination of Bacterial Endotoxin in Xingnaojing Injection by Kinetic Turbidimetry

TANG Qiu-hua, LIN Hui, ZHANG Yi-fan, HUANG Xiang-chang
(Affiliated Quanzhou First Hospital, Fujian Medical College, QuanZhou 362000, China)

ObjectiveTo establish a method to determine the content of bacterial endotoxin in Xingnaojing injection.MethodsKinetic turbidimetric limulus test of bacterial endotoxin were used according to Chp 2010.Results1→100 solution of Xingnaojing injection showed no interference on test and the average recovery was in the range of 50%～200%.ConclusionThis method is rapid, accurate and sensitive.It can be used for bacterial endotoxin test for Xingnaojing injection.

Injection of Xingnaojing; Bacterial endotoxin; Kinetic turbidimetric limulus test

R927.12

B

1671-8194（2014）22-0021-02