离体和在体机械损伤致血管平滑肌增殖模型的建立

高林江刘幸平韩莎莎姜红岩李金玉黄展勤*

（1 汕头市中心血站，广东 汕头 515064；2 汕头大学医学院药理学教研室，广东 汕头 515041）

离体和在体机械损伤致血管平滑肌增殖模型的建立

高林江1刘幸平2韩莎莎2姜红岩2李金玉2黄展勤2*

（1 汕头市中心血站，广东 汕头 515064；2 汕头大学医学院药理学教研室，广东 汕头 515041）

目的建立离体和在体机械损伤致血管平滑肌增殖模型。方法原代培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs），体外建立机械划伤致VSMCs增殖模型，采用5-溴脱氧尿嘧啶（5-BrUd）掺入法，流式细胞术检测细胞增殖情况；整体动物上，采用新西兰兔左侧颈总动脉球囊损伤，术后7d 取颈总动脉段，常规病理切片，HE染色，观测血管内膜厚度、内膜面积、内膜厚度/中膜厚度、内膜面积/中膜面积。结果机械划痕损伤12 h后划伤处两侧的细胞开始有部分增殖和迁移，24 h后细胞增殖较为明显。流式细胞术检测机械损伤后细胞增殖增多（P＜0.05）。整体动物上，与假手术组比较，模型组术后7 d血管内膜厚度、内膜面积、内膜厚度/中膜厚度、内膜面积/中膜面积显著增加（P＜0.01）。结论机械损伤可以导致离体和在体血管平滑肌细胞增殖。

机械损伤；血管平滑肌细胞；增殖；离体；在体

尽管经皮冠状动脉介入术是治疗缺血性心脏病的重要手段，但由于机械损伤导致血管平滑肌细胞（VSMCs）的增殖和迁移，从而引起血管重塑和再狭窄（RS）往往影响了疗效[1]。本课题组一直致力于心血管药理的研究和心血管活性药物的研发，探讨血管平滑肌增殖的机制及其信号通路的调节，及RS的药物干预是本课题组的兴趣所在[2,3]。为深入研究机械损伤致血管平滑肌增殖的机制以及进行药物的干预，建立机械损伤致血管平滑肌增殖的离体和在体模型是基础，本实验室经过反复实验，成功建立了离体大鼠胸主动脉VSMCs机械损伤后增殖的模型以及模拟PTCA术后VSMCs增殖和RS的病理过程，建立了家兔球囊剥脱内皮致家兔颈动脉狭窄整体动物模型，为研究VSMCs增殖的机制和防治提供了较好的实验平台。

1 材料与方法

1.1 动物

健康SD大鼠（汕头大学医学院动物中心提供），体质量180 g左右，清洁级新西兰兔，体质量2.5 kg（汕头大学医学院动物中心提供），方案经我院实验动物伦理委员会审查通过。

1.2 药品与试剂

细胞增殖以及细胞DNA含量检测试剂盒（凯基生物科技公司）；TRIzol试剂（Invitrogen）；SABC免疫组化染色试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品；5-BrUd为Sigma公司产品。

1.3 仪器

倒置相差显微镜（德国Leica公司）；FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）

1.4 大鼠胸主动脉VSMCs培养及鉴定

①原代培养：Sprague-Dawley大鼠经处死，分离胸部主动脉刮除内膜，经Hank’s液洗净，在含1%胎牛血清的培养液中剪碎，贴壁，在37 ℃、95% O2+5% CO2培养箱培养4～6 h。5 d后换液继续培养。②传代培养：镜下观察到VSMCs长至融合后，以0.025%胰蛋白酶+0.20%EDTA消化液消化细胞，经离心，传代，在1%FBS+DMEM培养液于CO2培养箱中继续培养，3 d后换液。③细胞鉴定：倒置显微镜下，VSMC呈典型的“谷-峰”样生长，经VSMCs特异性抗体抗α-SM actin抗体免疫组化染色显示VSMC胞质内有棕色颗粒，阳性细胞达95%以上。实验用第3～4代细胞。

1.5 离体机械损伤VSMCs的制备与培养

报道的方法[4]，制备模拟PTCA球囊扩张或支架造成血管平滑肌的机械性损伤的离体细胞模型，用消毒后的玻璃棒钝端沿着擦刮平铺在培养皿上的平滑肌细胞，造成机械损伤，观察再生和迁移的情况时，在损伤的基础上，沿直线划分细胞刮除区，刮除细胞，造模成功后，继续培养，方法同上。

1.6 5-溴脱氧尿嘧啶（5-BrUd）掺入法检测细胞增殖情况

VSMCs细胞培养至对数生长期，90%贴壁（6 cm培养皿）后换无血清培养基培养12～18 h，加入相应的试剂，然后用100 mL枪头在皿中划线，每皿划线方向和数量一致，造成机械划伤模型。加入10 μLBrdu（1 mmoL/L），在培养箱中继续培养3 h。经收集、处理细胞后流式细胞仪检测BrdU和7-AAD共染阳性率。

1.7 新西兰兔颈总动脉内膜球囊损伤模型的建立

参照文献介绍方法，建立新西兰兔颈总动脉内膜球囊损伤模型[5]。新西兰兔经麻醉，消毒，分离左侧颈总动脉以及颈内动脉和颈外动脉。在颈外动脉结扎处近端做一“V”形切口，向近心端插入2.0F球囊导管到颈总动脉，然后通过压力泵加压球囊，回拉充分膨胀的球囊至颈内、颈外动脉分叉处，停30 s后再回送球囊，造成球囊摩擦损伤颈总动脉，并此动作重复3次。实验结束后，缝合伤口，每天肌注80万U青霉素，连续3 d，避免伤口感染。

1.8 病理标本及形态学的观察

球囊损伤后7 d后处死新西兰兔，充分清洗颈总动脉后，10%中性福尔马林固定颈总动脉24 h，常规石蜡包埋，制备血管切片，进行HE染色。血管横切面图像用计算机图像分析系统，测定血管新生内膜厚度、新生内膜面积、中膜厚度、中膜面积、并计算新生内膜面积/中膜面积。

2 结 果

2.1 机械损伤致VSMCs增殖大体观察

采用划线法，体外建立VSMCs机械损伤模型，促使VSMCs增殖，图1显示了不同时间点下划伤处VSMCs损伤的情况，可观察到损伤12 h后划伤处两侧的细胞开始有部分增殖和迁移，24 h后细胞增殖较为明显。

2.2 机械损伤对VSMCs增殖的影响

流式细胞仪检测正常培养组（Control组）和机械损伤组（model组）BrdU和7-AAD共染阳性率，如图2所示。7-AAD是染色晚期凋亡及死亡细胞，显示在右下区；左上区是单染Brdu细胞。左下区显示的是双阴性细胞。右上区是BrdU和7-AAD共同染色区域，即增殖细胞。图2B机械损伤组的细胞右上区域比图2A正常培养组右上区细胞量增多，说明细胞明显增殖。

2.3 血管形态学观测结果

图3A显示假手术组兔颈总动脉内膜仅由一层内皮细胞构成，内、外弹力膜结构整齐，中膜层VSMCs成梭形排列。图3 B显示机械损伤组血管在术后7 d有新生内膜，并增厚，中膜平滑肌增殖，向内膜迁移，VSMCs核体积明显增大，胞质增多。

3 讨 论

VSMCs异常增生是动脉粥样硬化斑块形成和血管损伤后发生的血管再狭窄等多种疾病的共同病理特征。深入研究VSMCs增殖的因素及机制对心血管疾病的防治有着重要的意义。然而，一个好的VSMCs增殖模型是研究VSM增殖的重要前提。

本实验直接采用正常血管贴壁培养传代细胞，并用划痕方法造成血管平滑肌的机械损伤。我们观察了这种机械损伤对血管平滑肌的时效关系，大体可观察到损伤12 h后损伤处的细胞开始增殖和迁移，24 h后细胞增殖较为明显，说明机械损伤可导致血管平滑肌的增殖。

溴脱氧尿嘧啶核苷是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU与胸腺嘧啶竞争掺入的强度可能与细胞增殖有关，如肝癌细胞约11.6%的胸腺嘧啶被替代，而正常肝细胞仅有1.1%[6]。近年来非放射性标志物的研究发展迅速，然而其敏感性多数不及同位素，使实验受限。自1982年Gratzer制备出抗BrdU单抗及标记检测技术不断改良提高，用BrdU标记的敏感性已与氘胸腺嘧啶核苷相似。目前认为BrdU是最有希望取代同位素的非放射性标志物之一。本实验在形态学观察的基础上，通过应用流式细胞仪检测正常培养组（Control组）和机械损伤组（model组）BrdU和7-AAD共染阳性率，实验结果证实机械损伤后血管平滑肌细胞明显增殖。

图1 血管平滑肌细胞体外机械损伤模型

图2 5-BrUd掺入法检测机械损伤细胞增殖的影响

图3 兔颈总动脉HE染色

Rs的发生过程复杂，目前认为血管内皮损伤，从而导致血管平滑肌增殖，并向内膜迁移，增厚是引起经皮冠状动脉介入术后再狭窄的主要机制[7]。新西兰兔的血管接近人类血管生物学原理，易于复制血管损伤模型。因此本实验模拟人类经皮冠状动脉介入术，采用动脉球囊，造成血管机械损伤，并通过形态学观察RS形成过程中血管内膜和中膜的动态变化。本实验的HE染色结果显示，血管在球囊损伤后7 d，可见有新生内膜，内膜增厚，大量的平滑肌细胞增殖并迁移至内膜，此结果与文献报道一致[8]。

综上所述，本实验从离体培养的血管平滑肌细胞整体动物颈总动脉均成功建立了机械损伤血管平滑肌增殖模型，为进一步研究机械损伤致血管平滑肌增殖的机制及探讨药物防治血管再狭窄打了坚实的实验平台。

参考文献

[1] Togni M,Windecker S.Sirolimus-eluting stents associated with paradoxic coronary vasoconstriction[J].J Am Coll Cardiol,2005, 46(2):231-236.

[2] 黄展勤,韩莎莎.碘化N-正丁基氟哌啶醇抑制机械损伤诱导的血管平滑肌细胞增殖的作用及机制[J].中国药理学通报,2012,28(8):1115-1119.

[3] 黄展勤,李金玉.碘化N-正丁基氟哌啶醇对血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大的抑制作用[J].中国药理学通报,2013,29(7):913-917.

[4] Liang KW,Ting CT.Berberine suppresses MEK/ERK-dependent Egr-1 signaling pathway and inhibits vascular smooth muscle [J]. Biochem Pharmacol,2006,71(6):806-817.

[5] Morishita R,Gary H.Intimal hyperplasia after vascular injury isinhibited by antisense cdk 2 kinase oligonucleotides[J].J Clin Invest,1994,93(4):1458–1464.

[6] Knol JA.Walker SC.Incorporation of 5-bromo-2deoxyuridine into colorectal liver metastases and liver[J].Cancer Res,1995, 55(12):3687.

[7] Ciro Indolf i,Daniele Torella.Rat carotid artery dilation by PTCA balloon catheterinduces neointima formation[J].Am J Physiol Heart Circ,2002,283(2):H760-767.

[8] Wang L,Zheng JG.ADAMTS-7 Mediates Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation[J].Circ Res,2009,104(5):688-698.

Establishment of the Proliferation Model of Vascular Smooth Muscle Cells Induced by Mechanical Injury in Vitro and in Vivo

GAO Lin-jiang1, LIU Xing-ping2, HAN Sha-sha2, JIANG Hong-yan2, LI Jin-yu2, HUANG Zhan-qin2*
(1 Shantou Blood Center, Shantou 515064, China; 2 Department of Pharmacology, Shantou University Medical College, Shantou 515041, China)

ObjectiveTo establish the proliferation model of vascular smooth muscle cells induced by mechanical injury in vitro and in vivo.MethodsThe primarily cultured rat thoracic aortic SMCs were used to establish mechanical injury models in vitro. The proliferation activity of VSMCs was analyzed by flow cytometry with 5-BrUd incorporation. The proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) in vivo was established by balloon injury on the rabbit carotid artery. After 7 days, experimental segments of arteries were harvested and subsequently progressed routine pathological sections, hematoxylineosin staining.ResultsThe proliferation and migration of VSMCs were observed after 12h mechanical injury, especially after 24h. Compared with the sham group, the proliferative cells were increased by mechanical injury by the analysis of flow cytometry(P＜0.05). Tthe intimal thickness, intimal area, intimal/medial thickness and intima-to-media area ratio of the Model group significantly increase comparing to the sham group (P＜0.01).ConclusionThe proliferation model of vascular smooth muscle cells induced by mechanical injury in vitro and in vivo were successfully established.

Mechanical damage; Vascular smooth muscle cells; Proliferation; Vitro; In vivo

R654.2

B

1671-8194（2014）22-0001-02

国家自然科学基金资助项目（No.30901810），广东省自然科学基金资助项目（No. 9151063201000072）和汕头市重点科技计划项目（2008年度）

*通讯作者