津力达对高脂诱导的胰岛素抵抗ApoE－／－小鼠骨骼肌胆固醇相关基因的影响

金 鑫，张彦芬，秘 尧，何其龙，周升山，张会欣，，崔雯雯

（1.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨 150040；2.河北以岭医药研究院国家中医药管理局重点研究室，河北 石家庄 050035；3.河北省络病重点实验室，河北石家庄 050035）

近几十年来，由于人类久坐不动的生活方式和高卡路里的饮食，糖尿病等代谢性疾病已成为继恶性肿瘤、心血管疾病后危害人类生命健康安全的第三大非传染性疾病，成为了大多数国家的公共卫生问题［1］。近年来，一些中成药的降糖效果得到认可，在糖尿病治疗方面取得了可喜成果。降糖中成药津力达（Jinlida，JLD）能够降低糖尿病患者的胆固醇、甘油三酯等水平，但其具体的作用机制还不明确。高脂诱导具有脂代谢紊乱遗传背景的ApoE－／－小鼠，使其成为具有胰岛素抵抗（IR）表现特征的模型，更贴近人类发病方式。IR是引起糖尿病等代谢性疾病的一个重要特征，而骨骼肌又是IR发生的重要部位［2－3］。我们观察高脂诱导的 IR状态下的ApoE－／－小鼠的骨骼肌胆固醇相关基因的变化，来探讨津力达改善IR的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 津力达颗粒由人参、黄精、苍术（炒）、苦参、麦冬等17味中药组成，石家庄以岭药业股份有限公司提供，批号：120429；盐酸罗格列酮片由贵州圣济堂制药有限公司生产，批号20120202；油红O染色试剂盒购自南京建成科技有限公司；胰岛素受体（INSR）、胰岛素受体底物（IRS-1）、低密度脂蛋白受体（LDLR）抗体均购于Abcam公司；固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白（SCAP）抗体购于 Santa Cruz公司；INSR、IRS-1、LDLR、SCAP引物均购自上海生工生物公司。

1.2 实验动物 ApoE－／－小鼠、C57BL／6J小鼠，♂，18～20g，SPF级，均购自北京大学医学部，许可证号：SCXK（京）2011－0012，动物合格证号：C57BL／6J小鼠（0302333），ApoE－／－小鼠（0302331）。

1.3 实验饲料 实验基础饲料购自河北医科大学实验动物中心，配方：热量组成：碳水化合物65.5%，脂肪 10.3%，蛋白质 24.2%，总热量为348kcal／100 g；自制高脂饲料热量组成：碳水化合物20.1%，脂肪59.8%，蛋白质占20.1%，总热量为501kcal／100 g。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 10只♂ C57BL／6J小鼠设为正常对照组（NF），给予正常饲料；50只♂ ApoE－／－小鼠，给予高脂饲料，喂养16周后，分为5组：模型组（HF）、罗格列酮组 （LGLT）、津力达高剂量组（JLDH）、津力达中剂量组（JLDM）。津力达低剂量组（JLDD），津力达用纯水配制，按照小鼠体重高剂量 3.8 g·kg－1·d－1、中剂量 1.9 g·kg－1·d－1、低剂量0.95 g·kg－1·d－1灌胃给药，盐酸罗格列酮片按1.33 mg·kg－1·d－1灌胃给药。正常对照组、模型组给予纯水，连续8周，处死小鼠后，留取血清；骨骼肌股四头肌标本，－80℃保存备用。

1.4.2 血清生化指标检测 空腹血糖（FBG）、甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）均在全自动生化分析仪上检测。

1.4.3 胰岛素敏感性评价 空腹血清胰岛素（FINS）水平测定采用放射免疫分析法检测，计算胰岛素敏感指数（ISI）评价其胰岛素抵抗程度，ISI＝1／（FBG×FINS）。

1.4.4 形态学检测 少量新鲜骨骼肌组织进行冰冻切片，切片采用油红O染色方法光镜下观察小鼠骨骼肌脂肪蓄积程度。

1.4.5 骨骼肌TC代谢相关代谢基因mRNA表达水平的检测 取小鼠骨骼肌组织匀浆，并用Trizol法提取总RNA后，反转录反应。采用实时荧光定量反转录PCR（RT-PCR）方法检测小鼠骨骼肌INSR、IRS-1、LDLR、SCAP mRNA的表达。内参 β-actin及各目的基因引物序列如下：INSR上游引物：5′-TTTGCCCAACCATCTGTAAG-3′，下 游 引 物：5′-GACCATCCAGGTAGAAGTTTCG-3′；IRS-1上游引物：5′-AAGGAGGTCTGGCAGGTTATC-3′，下游引物：5′-ATGGTCTTGCTGGTCAGGC-3′；LDLR 上 游 引 物：5′-TGAAGAATGTGGTGGCTCTC-3′，下游引物：5′-ACTGATGATGGTGTCGTAGGA-3′；SCAP上游引物：5′-CAAAGAGGAGATTGGCATTG-3′，下 游 引 物：5′-TGCGTGTGGAGAAGTAGATGT-3′；β-actin上 游 引物：5′-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3′，下游引物：5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。反 应 结束 后，按照各反应孔Ct值，以β-actin基因为内参，根据公式2－△Ct计算各样品目的基因相对表达量。

1.4.6 骨骼肌组织胆固醇代谢相关蛋白表达水平测定 采用Western blot法测定小鼠骨骼肌INSR、IRS-1、LDLR、SCAP蛋白表达水平。取骨骼肌组织100 mg，加入1 ml细胞裂解液，充分裂解并定量。取30μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，完毕后，对凝胶进行半干转膜，转膜完毕取出，聚偏氟乙烯膜室温封闭2 h，将封闭后的聚偏氟乙烯膜置入稀释的一抗溶液中，4℃缓慢摇动过夜。洗膜后，将聚偏氟乙烯膜置入适量稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗溶液中，于室温反应2 h。抗体结合区带用化学发光法检测。以目的蛋白的IOD与β-actin的IOD比值表示该样品的目的蛋白相对含量。

1.4.7 统计学处理 用SPSS 13.0统计软件进行分析，各项数据资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 血清生化指标比较 与NF组相比，HF组小鼠FBG、TC、TG、LDL-C均明显升高，HDL-C明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与HF组相比，LGLT、JLDH组小鼠 FBG明显降低（P＜0.05）；LGLT、JLDL、JLDM、JLDH组小鼠 TC明显降低（P＜0.05）；LGLT、JLDM、JLDH组小鼠 TG含量降低（P＜0.05）；JLDM、JLDH组小鼠HDL-C明显升高（P＜0.05）；JLDH组小鼠 LDL-C明显降低（P＜0.05）。见Tab 1。

2.2 胰岛素敏感性评价 与NF组相比，HF组FINS水平升高，ISI降低（P＜0.05）；与HF组比较，LGLT组、JLDG组、JLDM组、JLDL组FINS水平明显下降，ISI均明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见 Tab 2。

Tab 1 Effects of JLD on biochemical parameters in blood（±s）

Tab 1 Effects of JLD on biochemical parameters in blood（±s）

＃P＜0.05 vs NF group；*P＜0.05 vs HF group

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Tab 2 Effects of JLD on FINS and ISI±s）

Tab 2 Effects of JLD on FINS and ISI±s）

＃P＜0.05 vs NF group；*P＜0.05 vs HF group

Group FINS／mU·L－1ISI NF 27.72±7.88 －5.05±0.39 HF 143.15±8.54＃ －7.03±0.13＃LGLT 56.85±11.08* －5.88±0.28*JLDL 119.82±4.89* －6.80±0.11*JLDM 92.13±9.78* －6.51±0.16*JLDH 60.09±12.05* －5.97±0.27*

2.3 骨骼肌油红O染色 NF组小鼠的骨骼肌基本没有脂肪蓄积，而HF组脂肪蓄积严重，LGLT组、JLDL组、JLDM组、JLDH组脂肪蓄积均有不同程度的减轻。见Fig 1。

2.4 骨骼肌 INSR、IRS-1、LDLR和 SCAP mRNA水平比较 与NF组比较，HF组骨骼肌INSR、IRS-1、LDLR mRNA水平均明显低于NF组（P＜0.05），SCAP mRNA水平明显高于NF组；与HF组比较，LGLT、JLDM、JLDH组 INSR、IRS-1 mRNA水平明显上升（P＜0.05）；JLDL、JLDM、JLDH组 LDLR mRNA水平均明显升高 （P＜0.05）；LGLT、JLDM、JLDH组SCAP mRNA水平明显下降（P＜0.05）。见Tab 3。

Tab 3 Effects of JLD on INSR，IRS-1，LDLR and SCAP mRNA expression（±s，n＝3）

Tab 3 Effects of JLD on INSR，IRS-1，LDLR and SCAP mRNA expression（±s，n＝3）

＃P＜0.05 vs NFgroup；*P＜0.05 vs HFgroup

Group INSR IRS-1 LDLR SCAP NF 1.04±0.18 1.03±0.14 1.00±0.14 0.91±0.17 HF 0.26±0.04＃ 0.33±0.04＃ 0.36±0.05＃ 2.91±0.54＃LGLT 0.79±0.14* 0.94±0.13* 0.33±0.05 2.31±0.42*JLDL 0.31±0.06 0.36±0.06 0.65±0.10* 2.77±0.21 JLDM 0.49±0.09* 0.75±0.12* 0.66±0.09* 1.48±0.21*JLDH 0.60±0.10* 0.88±0.13* 0.60±0.08* 1.38±0.13*

2.5 骨骼肌 INSR、IRS-1、LDLR和 SCAP蛋白表达比较 与NF组相比，HF组INSR、IRS-1、LDLR、SCAP蛋白表达差异均有统计学意义（P＜0.05）；与HF组相比，LGLT、JLDL、JLDM、JLDH组 INSR蛋白水平明显升高（P＜0.05）；LGLT、JLDM、JLDH的IRS-1的蛋白表达明显升高；JLDM、JLDH组LDLR蛋白水平明显升高（P＜0.05）；而 JLDL、JLDM、JLDH组SCAP蛋白表达则明显降低（P＜0.05），见Tab 4、Fig 2。

Tab 4 Effects of JLD on INSR，IRS-1，LDLR and SCAP protein expression（±s，n＝3）

Tab 4 Effects of JLD on INSR，IRS-1，LDLR and SCAP protein expression（±s，n＝3）

＃P＜0.05 vs NFgroup；*P＜0.05 vs HFgroup

Group INSR IRS-1 LDLR SCAP NF 1.12±0.10 1.23±0.13 0.70±0.10 0.17±0.01 HF 0.34±0.04＃ 0.60±0.01＃ 0.47±0.02＃ 0.80±0.10＃LGLT 0.75±0.07* 0.99±0.13* 0.44±0.06 0.73±0.11 JLDL 0.49±0.03* 0.66±0.07 0.49±0.04 0.48±0.08*JLDM 0.60±0.05* 0.83±0.08* 0.70±0.13* 0.44±0.07*JLDH 0.84±0.06* 1.03±0.08* 0.83±0.15* 0.29±0.05*

Fig 1 Oil red O staining of skeletal muscle（400×）

3 讨论

IR是引起许多代谢疾病如动脉粥样硬化、T2DM的共同病理、生理基础，研究IR的发生、发展过程对于人类深入探究代谢综合征具有深远的意义。骨骼肌是胰岛素的重要代谢场所，骨骼肌可以处置餐后70%～90%的葡萄糖［4］，现在普遍认为，骨骼肌细胞内的脂质含量过多是IR的一个重要因素。血液中的游离脂肪酸水平升高，以至于过多的游离脂肪酸游离到组织内，导致脂肪组织难以容纳和储存过多的脂肪酸，使脂质在骨骼肌内堆积，扰乱正常的组织能量代谢，进而产生了骨骼肌的胰岛素抵抗［5］。

ApoE－／－小鼠对于富含胆固醇的脂蛋白的清除有障碍，会导致高胆固醇血症［5］。本实验经过高脂饮食诱导的 ApoE－／－小鼠，TC、TG、FINS、FBG均明显升高，胰岛素敏感指数降低，表明其发生了明显的胰岛素抵抗。因此，长期高脂诱导的ApoE－／－小鼠可以作为一种很好的与人类致病因素比较相近的IR模型来探究IR［6］。我们也观察到长期高脂诱导的ApoE－／－小鼠，血脂水平明显升高，骨骼肌脂肪蓄积严重，而津力达组却有不同程度的改善，津力达能够降低血脂，提高胰岛素敏感程度，不同程度改善骨骼肌组织内的脂肪蓄积。

Fig 2 Protein expression of INSR，IRS-1，LDLR and SCAP in skeletal muscle1：NF；2：HF；3：LGLT；4：JLDL；5：JLDM；6：JLDH

为了进一步了解津力达在骨骼肌IR形成和发展过程的作用，及其与胆固醇代谢相关因素的关系，我们检测了小鼠骨骼肌INSR、IRS-1和两个关键的胆固醇的调控基因LDLR和SCAP的蛋白和mRNA的表达。胰岛素抵抗的发生多由于先天、环境等因素而引起胰岛素受体和受体后的缺陷所导致［7］。文献报道，胰岛素分泌以后，经过自身的血液循环到达靶细胞，与细胞表面的INSR相结合，经过一系列的去磷酸化和磷酸化的过程，激活多种激酶，活化IRS-1，然后再完成各种级联效应［8］，促进葡萄糖转运蛋白向细胞膜转位，完成组织的葡萄糖转运，调节外周的葡萄糖代谢。这一过程的任何一个环节发生问题，都将会影响胰岛素信号的传导，主要包括INSR的活性下降、葡萄糖转运减少、糖原合成酶活性降低、胰岛素信号转导异常等。本实验中，经过长期高脂诱导的ApoE－／－小鼠的胰岛素抵抗程度严重，实验结果发现，模型组INSR和IRS-1的水平明显降低，可能由于INSR或IRS-1的水平降低而产生IR，或者在IR的状态下，导致信号通路等因素发生改变，而使INSR和IRS-1产生不同程度的下降，进而使IR加重。津力达能上调INSR和IRS-1水平，提示津力达可能通过上调小鼠骨骼肌INSR和IRS-1表达，使小鼠胰岛素的敏感性上升，从而减轻小鼠的胰岛素抵抗程度。

LDLR是位于细胞表面的跨膜受体，主要功能是结合LDL或者其他载脂蛋白B100和载脂蛋白E（ApoE）的脂蛋白［9］。ApoE是血浆脂蛋白的重要成分，对体内胆固醇代谢和脂蛋白的分解起到关键作用。ApoE基因的缺失会引起LDL的代谢障碍，出现动脉粥样硬化病灶和高脂血症［10］。本实验采用ApoE基因敲除小鼠，ApoE基因缺失使得LDL代谢紊乱，进而引起LDLR的清除作用降低，使结合的LDLR的含量降低。为了维持胆固醇的恒定水平，胆固醇的摄入和合成有一系列的调节因子调控，包括膜结合转录因子胆固醇调节元件结合蛋白（SREBPs）和SREBP裂解激活蛋白（SCAP）等调控。目前，SCAP被认为是哺乳动物的脂质合成以及摄入的中心调节因子［11］。在机体的其他因素或者低胆固醇的情况下，SCAP和 SREBPs结合成为SREBP-SCAP复合物。该复合物被转运至高尔基体，随后在位点1蛋白酶和位点2蛋白酶依次裂解后，形成成熟的SREBPs片段进入细胞核，与SRE结合，从而促进相关基因的转录，使胆固醇的合成增强。在相关辅助因子的作用下，激活胆固醇和脂肪酸代谢基因的转录，从而增加细胞对外源性胆固醇的摄取和细胞内源性胆固醇的合成［12］。本研究中模型组SCAP表达升高，LDLR表达降低，津力达治疗后，可下调SCAP水平，从而抑制SREBPs的活化，下调胆固醇和脂肪酸代谢基因的表达，减少骨骼肌脂质的合成和摄取；同时，升高LDLR表达，提高胆固醇清除功能，调控骨骼肌代谢趋于正常，改善小鼠骨骼肌的胰岛素抵抗。

综上所述，经过长期高脂诱导的ApoE－／－小鼠是很好的胰岛素抵抗模型，津力达能够通过调节小鼠骨骼肌胆固醇代谢，改善胰岛素抵抗，但其具体机制还需进一步深入的研究。

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