白芍总苷对共培养诱生的破骨细胞的作用及机制
2014-05-17周玲玲柳璋璞刘天阳周学平
周玲玲,魏 伟,柳璋璞,周 聪,刘天阳,周学平
(1.南京中医药大学药学院,江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,江苏南京 210023;2.安徽医科大学临床药理研究所,安徽合肥 230032)
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以累及周围关节为主的炎症性自身免疫病,其致残原因主要为关节畸变。关节骨质破坏是关节畸变的重要因素,因此,治疗RA的最大课题就是控制骨损伤。
破骨细胞是引起RA骨破坏的关键细胞之一[1],在其分化过程中滑膜成纤维细胞起着重要作用[2],通过释放白介素(interleukin,IL)-1、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MCSF)等多种细胞因子,进而诱导破骨细胞分化因子(osteoclast differentiation factor/receptor activator of NF-κB ligand,ODF/RANKL)的表达[3]。RANKL和M-CSF作为刺激破骨前体细胞融合和分化成熟的关键因子,启动多种引起特定基因表达和转录的胞内信号转导通路[4-5]。其中,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)信号转导通路日益受到关注,它包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinases, ERKs)、p38MAPK、Jun-N末端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)等,而炎症性细胞因子是MAPK通路活化的诱导剂[6],细胞因子和信号通路交互影响,介导破骨细胞分化,导致骨破坏的发生。课题组围绕RA滑膜炎症和骨质破坏的内在联系,成功建立了佐剂关节炎(adjuvant induced arthritis,AIA)大鼠滑膜成纤维细胞和外周血单核细胞共培养诱生破骨细胞的模型,证实了细胞因子网络和信号通路在破骨细胞分化过程中的作用[7]。因此,调控参与破骨细胞分化的细胞因子和信号通路,可有效延缓骨破坏的发生与发展。
白芍总苷(total glucosides of paeony,TGP)是从亳白芍干燥根中提取的有效部位,主要成分为芍药苷等。在前期的系列研究中证实了TGP对RA的治疗作用,可调节细胞因子的分泌,调控MAPKs途径而减轻滑膜炎症[8-9]。TGP的不良反应少,长期使用病人耐受性好,可延缓骨质破坏的发生与发展,但其干预RA骨质破坏的机制尚未系统研究。因此,本项研究运用共培养诱生破骨细胞的模型,探讨TGP在破骨细胞分化过程中的作用及机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 SD大鼠,♂,180~220 g,由南京中医药大学动物中心提供,合格证号:SYXK(苏)2007-0030。
1.2 药品与试剂 白芍总苷(TGP):由安徽医科大学临床药理研究所提供。Ⅱ型胶原酶、噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazal-zyl)2,5-diphenyltetra-zolium bromide,MTT]:Sigma公司。胰蛋白酶:Amresco公司。dNTP混合液、PCR缓冲液、Taq聚合酶、100 bp DNA Ladder:天根生化科技有限公司。淋巴细胞分离液:中国医学科学院生物工程研究所。Transwell细胞小室:Corning公司。牙质片层:IDS Ltd产品。TRIzol:Invitrogen life technologies公司。MOPS、Tris-HCl、EDTA:华美生物工程公司。GAPDH引物:F:5′-GGAAAGCTGTGGCGTGAT-3′, R: 5′-AAGGTG GAAGAATGGGAGTT-3′;ERK1引物:F:5′-GACCA GAGTGGCTATCAAGAAGA-3′,R:5′-GGATGTCTCG GATGCCTATG-3′;p38引 物:F:5′-GGGACCTCCT TATAGACGAATG-3′,R:5′-TGAAGTGGGATGGAC AGAACA-3′;JNK1引物:F:5′-GGAGGAGCGAACTA AGAATGG-3′,R:5′-AGACTGCTGTCTGTATCCGAG G-3′。
1.3 主要仪器 680型全自动酶标仪:Bio-Rad。3111型CO2培养箱:FORMA SCIENTIFIC。IX71相差显微镜:Olympus。扫描电镜:Rotor-Gene 3000。Real time PCR仪:Corbett Research。引物设计软件(Primer 5.0 Rotor-gene 6.0):Corbett Research。
1.4 AIA大鼠滑膜成纤维细胞与单核细胞共培养模型的建立[7]按照前期建立的方法,SD大鼠30只,建立AIA大鼠模型,28 d后取大鼠新鲜抗凝血,分离外周血单核细胞;处死大鼠,无菌取滑膜组织,组织块贴壁培养获得滑膜成纤维细胞。24孔培养板内加入109cells·L-1单核细胞,将传代至3~5代的滑膜成纤维细胞制备成108cells·L-1细胞悬液,加入置于24孔培养板孔内的悬挂式培养小室中,5%CO2、37℃细胞培养箱中培养,3周后进行TRAP染色鉴定。
1.5 TGP对共培养诱生的破骨细胞增殖的影响共培养2周的破骨细胞中加入5、50、500、5 000 mg·L-1和 50 g·L-1的 TGP,5%CO2、37℃细胞培养箱中培养48 h,以MTT法检测各孔A值。
1.6 TGP对共培养诱生的破骨细胞TRAP活性的影响 共培养2周的破骨细胞中,分别加入5、50、500、5 000 mg·L-1和 50 g·L-1的 TGP,5%CO2、37℃细胞培养箱中培养48 h,取各孔上清,检测TRAP活性。
1.7 TGP对破骨细胞所致骨吸收陷窝面积的影响
消化共培养2周的下层破骨细胞,加入预置象牙片的96孔板,浓度为 107cells·L-1,5%CO2、37℃培养24 h后,将5、50、500、5 000 mg·L-1和 50 g·L-1的 TGP分别加入各孔,5%CO2、37℃培养 48 h,换液后继续培养3 d,取出骨片,扫描电镜观察骨片破骨细胞吸收陷窝,Leica图像分析仪计算骨吸收陷窝的面积。
1.8 TGP对共培养系统上清液中细胞因子的影响
共培养细胞1周后,系统中加入5、50、500、5 000 mg·L-1和 50 g·L-1的 TGP,5%CO2、37℃细胞培养箱中培养48 h,取各孔上清,ELISA法检测上清中IL-1、TNF-α、M-CSF、RANKL的水平。
1.9 TGP对共培养破骨细胞分化中MAPKs通路的影响 滑膜成纤维细胞与单核细胞共同培养1周后,将50、500、5 000 mg·L-1的 TGP分别加入各孔,5%CO2、37℃细胞培养箱中培养48 h,收集分化的破骨细胞,加入TRIzol,提取总RNA,定量PCR检测JNK、ERK、p38的表达。每个待测的基因和管家基因GAPDH进行PCR反应,将PCR产物梯度稀释进行real time PCR反应:95℃,5 min;40个 PCR循环(95℃,10 s;59℃,15 s;72℃,20 s;83.5℃,5 s)。反应结束后进行结果分析,每个样品的目的基因浓度除以管家基因的浓度,即为此样品此基因的校正后的相对含量。
1.10 统计学方法 实验数据用x¯±s表示,采用SPSS 11.5软件包进行单因素方差分析比较组间差异。
2 结果
2.1 共培养破骨细胞形态学观察 加入培养的AIA大鼠滑膜成纤维细胞至悬挂小室中,细胞很快贴壁生长并连接成片。底层的单核细胞逐渐分化,约2~3周,形成破骨细胞样形态。TRAP染色为阳性细胞,扫描电镜显示其具备骨吸收功能(Fig 1)。
2.2 TGP对共培养诱生的破骨细胞增殖反应的影响 Tab 1结果显示,TGP 5 mg·L-1给药对破骨细胞的增殖能力有抑制趋势,但较对照组差异无显著性;TGP 50、500、5 000 mg·L-1可不同程度抑制共培养诱生的破骨细胞的增殖,与对照组比较差异有显著性(P<0.05,0.01);TGP 50 g·L-1的抑制作用也较明显(P<0.01),但较5 000 mg·L-1略有下降。提示TGP抑制破骨细胞的作用只在一定范围内具有良好的线性关系。
Fig 1 Monocytes of AIA rats co-cultivated with synovial fibroblasts for 21 daysA:osteoclasts(100×);B:TRAP-positive cells(100×);C:bone resorption(600×)
Tab 1 Effects of TGP on proliferation of co-cultured osteoclasts±s,n=8)
Tab 1 Effects of TGP on proliferation of co-cultured osteoclasts±s,n=8)
*P<0.05,**P<0.01 vs control
Group Dose/mg·L-1Proliferation/A Control - 0.459±0.038 TGP 5 0.387±0.062 50 0.321±0.046*500 0.226±0.040**5 000 0.186±0.047**50 000 0.220±0.045**
2.3 TGP对共培养诱生的破骨细胞TRAP活性的影响 Tab 2结果显示,TGP 5 mg·L-1给药对破骨细胞的TRAP活性影响不明显;TGP 50、500、5 000 mg·L-1给药可浓度依赖性地抑制共培养诱生的破骨细胞的TRAP活性,与对照组比较差异有显著性(P<0.01);TGP 50 g·L-1给药亦可明显抑制TRAP活性(P<0.01),但作用较 5 000 mg·L-1略有下降。
2.4 TGP对共培养诱生的破骨细胞骨吸收的影响Tab 3结果显示,TGP 5 mg·L-1对破骨细胞所致骨吸收陷窝面积的影响不明显;TGP 50、500、5 000 mg·L-1给药可浓度依赖性地抑制骨吸收陷窝面积,与对照组比较差异有显著性(P<0.05,0.01);TGP 50 g·L-1也可明显抑制破骨细胞骨吸收面积(P<0.01),但作用较5 000 mg·L-1略有下降。
2.5 TGP对共培养系统上清中细胞因子水平的影响 Tab 4结果显示:TGP 5 mg·L-1给药对上清中细胞因子水平影响不明显;TGP 50、500、5 000 mg·L-1给药可浓度依赖性地抑制共培养系统上清液中IL-1、TNF-α、M-CSF、RANKL的水平,与对照组比较差异有显著性(P<0.05,0.01)。TGP 50 g·L-1也可明显抑制上述细胞因子水平(P<0.01),其作用与 5 000 mg·L-1相当。
2.6 TGP对共培养破骨细胞MAPKs表达的影响
Tab 5结果显示:TGP 500、5 000 mg·L-1给药可明显抑制共培养系统破骨细胞的ERK1、JNK1、p38的表达,且抑制作用与TGP浓度成正比,与对照组比较差异有显著性(P<0.05,0.01)。
Tab 2 Effects of TGP on activity of TRAP of co-cultured osteoclasts(±s,n=8)
Tab 2 Effects of TGP on activity of TRAP of co-cultured osteoclasts(±s,n=8)
*P<0.05,**P<0.01 vs control
Group Dose/mg·L-1 TRAP/U·L-1 Control - 6.56±1.72 TGP 5 5.42±0.89 50 4.31±0.76*500 3.17±0.65**5 000 2.32±0.61**50 000 3.35±0.57**
Tab 3 Effects of TGP on bone resorption functions of co-cultured osteoclasts(±s,n=4)
Tab 3 Effects of TGP on bone resorption functions of co-cultured osteoclasts(±s,n=4)
*P<0.05,**P<0.01 vs control
Group Dose/mg·L-1 Resorption area/μm2 Control - 20.31±3.35 TGP 5 17.26±3.17 50 11.37±2.18*500 7.75±2.40**5 000 3.17±2.59**50 000 5.96±2.21**
3 讨论
在RA骨破坏的过程中,破骨细胞的过度增殖打破了成骨细胞和破骨细胞之间的平衡状态,骨质破坏随之发生[10]。课题组前期采用AIA大鼠滑膜成纤维细胞作为基质细胞,外周血单核细胞作为破骨细胞前体细胞,两种细胞分别独立培养,但培养液可以互通,成功诱导出破骨样细胞。在共培养的过程中不需要添加外源性刺激因子,这提示滑膜成纤维细胞所分泌的细胞因子可刺激破骨前体细胞分化为破骨细胞。因此,这种共培养的方式可以更好地体现RA的病理过程,适合于药物的作用机制研究。
TGP治疗RA的疗效确切,可缓解RA骨破坏进程[11],因此,本课题进一步研究其干预骨破坏的机制。在建立上述共培养诱生破骨细胞模型的基础上观察TGP的作用,结果显示:一定剂量的TGP可以抑制破骨样细胞的分化增殖,抑制其TRAP活性,降低其骨吸收能力,说明TGP可以抑制破骨细胞的分化和活性。
细胞因子网络在破骨细胞分化的过程中起着重要作用。现普遍认为 M-CSF、RANKL、TNF-α、IL-1是重要的正调控因素[12],滑膜成纤维细胞可分泌过量的细胞因子,进而通过信号转导途径影响破骨细胞分化、活化的多个环节。本研究结果显示:一定剂量的TGP可明显抑制共培养系统中上述细胞因子的分泌,这提示抑制滑膜成纤维细胞分泌与细胞分化和活化相关的细胞因子,可能是TGP抑制破骨细胞的一个重要机制。
破骨细胞的分化受到很多因素的影响,MAPKs信号转导通路也是一个重要的调节途径。活化的ERK、JNK、p38 MAPK能刺激破骨细胞前体的分化、生存、融合及活化成熟的破骨细胞[3,13]。我们前期的研究结果也证实MAPKs在共培养诱生破骨细胞过程中的作用[7]。本研究结果显示:一定剂量的TGP可抑制上述破骨细胞ERK、JNK、p38蛋白的表达,说明抑制MAPKs信号途径也是TGP抑制破骨细胞分化和活性的途径之一。IL-1和TNF-α被看作为“上游”的细胞因子,可诱导产生“下游”的细胞因子,共同促进破骨细胞前体增殖、分化形成破骨细胞,加速骨吸收,它们对RANKL和MAPKs通路的活化亦具有明显促进作用[6,14]。另外,RANKL和M-CSF也可促进 MAPKs的活化[15],因此,TGP对MAPKs通路的抑制作用还可能与抑制上述细胞因子的分泌而干预MAPKs蛋白的活化密切相关。
研究中还发现,TGP对RA破骨细胞的抑制作用与剂量呈明显相关,在TGP 50~5 000 mg·L-1具有较好的抑制作用,且具有良好的剂量-效应关系,TGP浓度达到50 g·L-1时抑制作用不再增强或有所减弱,提示 TGP 50~5000 mg·L-1是抑制RA破骨细胞分化的最适浓度。
上述结果提示:一定剂量的TGP可明显抑制RA破骨细胞的分化和活性,其作用与抑制滑膜成纤维细胞过度分泌细胞因子,进而阻止MAPKs信号途径的活化有关。
Tab 4 Effects of TGP on levels of cytokines in supernatant of co-cultured osteoclasts(±s,n=4)
Tab 4 Effects of TGP on levels of cytokines in supernatant of co-cultured osteoclasts(±s,n=4)
*P<0.05,**P<0.01 vs control
Group Dose/mg·L-1 IL-1/mg·L-1 TNF-α/mg·L-1 M-CSF/mg·L-1 RANKL/mg·L-1 Control - 458.11±51.63 156.50±25.02 16.25±1.94 30.24±4.99 TGP 5 384.59±66.40 127.25±12.15 13.16±1.35* 24.99±6.18 50 360.22±31.46* 97.25±12.44* 11.97±1.79** 16.74±4.25*500 313.49±21.32** 79.00±9.35** 7.81±1.67** 12.49±4.74**5 000 240.24±27.57** 54.25±11.05** 5.72±2.65** 7.95±2.15**50 000 236.87±31.11** 55.50±10.26** 5.35±2.55** 7.57±2.53**
Tab 5 Effects of TGP on expression of ERK,p38 and JNK expression in co-cultured osteoclasts(±s,n=3)
Tab 5 Effects of TGP on expression of ERK,p38 and JNK expression in co-cultured osteoclasts(±s,n=3)
*P<0.05,**P<0.01 vs control
Group ERK1/GAPDH p38/GAPDH JNK1/GAPDH Control - 0.483±0.096 0.145±0.005 0.335±0.0 Dose/mg·L-1 36 TGP 50 0.369±0.016 0.131±0.003 0.258±0.026 500 0.248±0.053* 0.121±0.010* 0.138±0.018**5000 0.213±0.020**0.073±0.019**0.091±0.033**
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