硫化氢抑制离体灌流大鼠急性心肌缺血所致心肌细胞凋亡研究

谢英花，马燕山，张 楠，张建新

（1.河北科技大学药学系，河北 石家庄 050018；2.石家庄市中医院放射科，河北 石家庄 050051；3.河北省医学科学院，河北石家庄 050021）

心肌缺血性损伤严重危害人类健康，是由冠状动脉供血不足，心肌急剧的暂时的缺血和缺氧引起。若不及时处理，可诱发心绞痛及心肌梗死。研究表明，心肌细胞凋亡是心肌缺血、缺血／再灌注损伤、心力衰竭等的重要病理生理机制［1－3］。据报道，硫化氢（H2S）可调节心血管系统功能，抑制心肌细胞凋亡［2，4－5］。但是，其对离体灌流大鼠急性心肌缺血所致细胞凋亡的作用尚未见报道。为此，本研究观察外源性H2S对离体灌流大鼠急性心肌缺血所致细胞凋亡的影响，为心肌缺血性损伤的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 NaHS、苯甲基磺酰氟（PMSF）、过硫酸 胺 （APS）、N，N，N，N-四 甲 基 乙 二 胺（TEMED）、甘氨酸、PVDF膜均购自美国 Sigma公司；兔caspase-3多克隆抗体、小鼠Cyt-C单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；RIPA组织／细胞裂解液、N，N-亚甲双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠（SDS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）购自北京索莱宝科技有限公司；细胞核蛋白／浆蛋白抽提试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；预染蛋白Marker、BCA法蛋白定量试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；TUNEL试剂盒（In situ cell death detection kit-POD）购自美国Roche公司。

1.2 仪器 高速冷冻离心机1-15k（美国Sigma公司）；T-05X20-2A凝胶扫描分析系统（法国VL公司）；水平电泳仪、水浴电转膜仪（北京市六一仪器厂）；光学显微镜（日本Olympus公司）；石蜡切片机、捞片机（德国Leica公司）

1.3 模型制备及动物分组 健康♂SD大鼠40只（SPF级），体质量250～290 g，由河北省实验动物中心提供。大鼠腹腔注射10%水合氯醛350μg·g－1麻醉后，迅速开胸，取出心脏，置于盛有混合气饱和预冷K-H液的平皿中，清洗残留血液，经主动脉逆行插管，悬挂于Langendorff灌注装置，混合气饱和的K-H液恒压灌注。平衡20 min后，结扎冠状动脉左前降支，引起心肌急性缺血。

将动物随机分为5组：假手术组（Sham组，冠状动脉左前降支只穿线但不结扎，其余操作同Ischemia组）、缺血组（Ischemia组，冠状动脉左前降支结扎4 h，正常灌流液灌流）、NaHS5、10、20μmol·L－1后处理剂量组（冠状动脉左前降支结扎2 h时更换为5、10、20μmol·L－1NaHS的灌流液，其余操作同Ischemia组）。

1.4 心肌组织病理学分析 心脏灌流结束后，摘取心脏，冲净，取左心室前壁组织，在质量浓度为100 g·L－1的多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脱水，浸蜡包埋，制成光镜切片，苏木精－伊红（HE）染色，光学显微镜下观察心肌组织病理性损伤改变。

1.5 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 上述心肌组织石蜡切片采用TUNEL法（脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法）检测心肌细胞凋亡，严格按试剂盒说明书进行标记染色。光镜可见凋亡细胞核染成棕褐色，高倍镜下每张切片随机取5个以上视野，计算凋亡百分率。

1.6 Western blot法半定量测定心肌组织中caspase-3、Cyt-C蛋白表达 分别处理心肌组织，提取得到心肌组织中总蛋白（测定Cyt-C）和浆蛋白（测定caspase-3）。将所得心肌组织总蛋白或浆蛋白样品与上样缓冲液热变性，行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，用 TBST洗涤，5%脱脂奶粉封闭，加稀释的caspase-3、Cyt-C一抗，再加相应的二抗，ECL显色，扫描条带，转换为数字图像，Image J图像分析软件半定量分析蛋白条带。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织病理学改变 光镜下可见Sham组心肌肌原纤维完整，排列整齐，无水肿、变性坏死等改变，心肌组织结构正常；Ischemia组存在局灶性病变，明显变性坏死，水肿及炎性浸润，心肌纤维呈波浪样改变，排列紊乱，部分断裂；而NaHS 5、10、20μmol·L－1后处理剂量组呈剂量依赖性地减轻心肌组织损伤的病理学改变（Fig 1）。

2.2 各组大鼠心肌细胞凋亡率的变化 如Fig 2所示，Ischemia组心肌细胞凋亡数明显增加，凋亡率（24.36±1.56）%明显高于 Sham组（9.83±1.26）%（P＜0.01），NaHS 10、20μmol·L－1后处理剂量组细胞发生凋亡水平降低，凋亡率分别为（16.24±0.92）%、（13.29±0.78）%，明显低于 Ischemia组（P＜0.01）。

2.3 各组大鼠心肌组织caspase-3和Cyt-C的蛋白表达情况 如Fig 3所示，与Sham组比较，Ischemia组Cyt-C和caspase-3的蛋白表达增强（P＜0.01）。与 Ischemia组比较，NaHS 10、20μmol·L－1后处理剂量组caspase-3的蛋白表达减弱（P＜0.05或P＜0.01）；NaHS 5、10、20μmol·L－1后处理剂量组 Cyt-C的蛋白表达下降（P＜0.05或P＜0.01）。

Fig 1 Effects of H 2 S on the pathological changes of myocardial tissue in rats by optical microscope（HE×200）A：Sham；B：Ischemia；C：5μmol·L－1 NaHS；D：10μmol·L－1 NaHS；E：20μmol·L－1 NaHS

3 讨论

H2S是继NO和CO之后的又一种内源性气体信号分子。内源性H2S是由半胱氨酸经胱硫醚-β-合酶（CBS）、胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）及 3-巯基丙酮酸转硫酶（3MST）催化而产生，其中，CSE主要表达于血管组织和心肌中［6］。越来越多的研究表明，内源性H2S或其供体如Na2S、NaHS可发挥广泛的心血管保护效应［2］。其中，H2S对心肌凋亡具有广泛的拮抗效应，可明显抑制氯化钴或糖尿病心肌损伤引起的心肌 caspase-3活化、心肌细胞凋亡率升高［7－8］。研究证实，H2S对缺氧／复氧（H／R）心肌细胞凋亡的保护作用与拮抗线粒体通透性转换孔道开放有关［9］。此外，在糖尿病大鼠心肌缺血／再灌注损伤中，H2S可通过下调细胞凋亡基因fas、fas配体（FasL）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达，阻断细胞表面死亡受体途径，发挥其保护作用［10］。

Fig 2 Apoptotic rate of myocardial cell byTUNEL assay in rats（×200）A：Sham；B：Ischemia；C：5μmol·L－1 NaHS；D：10μmol·L－1 NaHS；E：20μmol·L－1NaHS.**P＜0.01 vs sham group；＃＃P＜0.01 vs ischemia group

细胞凋亡可能是心肌细胞损伤中的重要环节之一，抑制细胞凋亡便能明显缩小心肌梗死的面积［3，11－12］。本文通过 TUNEL法检测发现，缺血 4 h后，Ischemia组心肌细胞凋亡数明显高于Sham组（P＜0.01），证实了缺血损伤可诱导心肌细胞凋亡发生。而 NaHS 10、20μmol·L－1后处理剂量组细胞凋亡率明显低于 Ischemia组（P＜0.01），说明NaHS后处理具有抑制缺血损伤所致心肌细胞凋亡的作用，光镜下心肌组织病理学改变也充分显示了这一点。NaHS后处理可明显逆转缺血所致的心肌纤维、细胞膜、细胞核等的结构改变。由上可见，NaHS后处理对离体灌流大鼠急性心肌缺血损伤有保护作用，且和其抑制心肌细胞凋亡有关。

凋亡机制的研究是现代心脏病学的研究重点。多基因参与介导调控的细胞凋亡主要涉及死亡受体通路和线粒体凋亡通路两条通路［13］。Caspase家族负责细胞凋亡的启动和执行，通过相应caspase基因的逐层激活，引起细胞的凋亡。在此级联反应中，caspase-3为关键性蛋白酶，caspase-3被上游信号激活后可作用于其底物，使级联反应放大，引起细胞凋亡。在线粒体凋亡通路中，线粒体肿胀、膜流动性降低、线粒体膜通透性转换孔开放，可促进细胞色素C（Cyt-C）等的释放，激活上游caspase蛋白酶，启动细胞凋亡［3，8，12－13］。本文通过 Western blot检测发现，Ischemia组 Cyt-C和 caspase-3的蛋白表达均比Sham组增强（P＜0.01），而 NaHS后处理剂量组Cyt-C的蛋白表达比Ischemia组减弱（P＜0.05或P＜0.01），NaHS 10、20μmol·L－1后处理剂量组caspase-3的蛋白表达比Ischemia组减弱（P＜0.05或P＜0.01）。因此，NaHS后处理抑制心肌缺血损伤引起细胞凋亡的机制可能与下调Cyt-C、caspase-3的蛋白表达有关，但它对其他凋亡相关蛋白的作用及机制，尚需进一步的深入研究。

Fig 3 Effects of H 2 S on the expression of caspase-3 and Cyt-C in myocardial tissue in rats by Western blotA：Sham；B：Ischemia；C：5μmol·L－1 NaHS；D：10μmol·L－1 NaHS；E：20μmol·L－1 NaHS.**P＜0.01 vs sham group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs ischemia group

我们实验室前期研究发现：离体急性缺血损伤心肌在给予NaHS后，离体心肌中CSE的活性和H2S的含量可不同程度上升，左心室血流动力学指标明显改善，心肌梗死体积明显缩小，可使急性心肌缺血损伤减轻［14］。结合上述研究结果可知，离体心肌缺血后，外源性补充H2S，随着心肌组织中H2S含量的升高，心肌组织中凋亡细胞减少，心肌缺血损伤减轻。从而表明H2S含量的变化对细胞凋亡起到重要的调节作用，其机制可能与减轻心肌细胞凋亡，下调Cyt-C、caspase-3的蛋白表达有关。

参考文献：

［1］ Hausenloy D J，Yellon D M.New directions for protecting the heart against ischaemia-reperfusion injury：targeting the reperfusion injury salvage kinase（RISK）-pathway［J］.Cardiovasc Res，2004，61（3）：448－60.

［2］ 廖 锋，郑 扬，耿 彬.硫化氢－新的心脏保护因子［J］.生理科学进展，2012，43（2）：111－4.

［2］ Liao F，Zheng Y，Geng B.Hydrogen sulfide-a new cardioprotective factor［J］.Prog Physiol Sci，2012，43（2）：111－4.

［3］ 史婷婷，白建平，梁月琴，等.芹菜素对大鼠缺血／再灌注心肌细胞凋亡及相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响［J］.中国药理学通报，2011，27（5）：666－71.

［3］ Shi T T，Bai JP，Liang Y Q，et al.Effect of apigenin on the cardiomyocyte apoptosis in rats with ischemia and reperfusion and the expression of Bcl-2，Bax，Caspase-3［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（5）：666－71.

［4］ Lavu M，Bhushan S，Lefer D J.Hydrogen sulfide-mediated cardioprotection：mechanisms and therapeutic potential［J］.Clin Sci（Lond），2011，120（6）：219－29.

［5］ 金红芳，杜军保，唐朝枢.“废气不废”：气体信号分子硫化氢的研究进展［J］.生理学报，2010，62（6）：495－504.

［5］ Ji H F，Du JB，Tang C S.“Waste gas is not waste”：advance in the research of hydrogen sulfide［J］.Acta Physiol Sin，2010，62（6）：495－504.

［6］ Eto K，Ogasawara M，Umemura K，et al.Hydrogen sulfide is produced in response to neuronal excitation［J］.J Neurosci，2002，22（9）：3386－91.

［7］ 廖新学，杨春涛，杨战利，等.硫化氢对抗化学性缺氧引起的心肌细胞损伤及其机制［J］.中国药理学通报，2009，25（8）：1012－7.

［7］ Liao X X，Yang C T，Yang Z L，et al.Hydrogen sulfide protects H9C2 cells against chemical hypoxia-induced injury and the underlying mechanisms［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（8）：1012－7.

［8］ 贾 强，杨 锐，马善峰，等.硫化氢对糖尿病大鼠心肌损伤保护作用及其抗凋亡机制研究［J］.安徽医科大学学报，2014，49（2）：172－6.

［8］ Jia Q，Yang R，Ma SF，et al.Anti-apoptotic role of hydrogen sulfide on cardio-protection in diabetic rats［J］.Acta Univ Med Anhui，2014，49（2）：172－6.

［9］ Yao L L，Huang X W，Wang Y G，et al.Hydrogen sulfide protects cardiomyocytes from hypoxia／reoxygenation-induced apoptosis by preventing GSK-3beta-dependent opening of mPTP［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，298（5）：1310－9.

［10］Gao Y，Yao X，Zhang Y，et al.The protective role of hydrogen sulfide in myocardial ischemia-reperfusion-induced injury in diabetic rats［J］.Int J Cardiol，2011，152（2）：177－83.

［11］Jiang C M，Han L P，Li H Z，et al.Calcium sensing receptors induce apoptosis in cultured neonatal rat ventricular cardiomyocytes during simulated ischemia／reperfusion［J］.Cell Biol Int，2008，32（7）：792－800.

［12］郭 佳，肖传实，白 瑞，边云飞.脂联素对大鼠缺血／再灌注心肌细胞凋亡及相关蛋白表达的影响［J］.中国药理学通报，2012，28（7）：930－3.

［12］Guo J，Xiao C S，Bai R，Bian Y F.Effects of adiponectin on the cardiomyocyte apoptosis in rats induced by ischemia and reperfusion and the expression of the related protein［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（7）：930－3.

［13］王 平，张建新，李兰芳，等.硫化氢对脂多糖诱导的大鼠肺组织细胞凋亡的影响［J］.中国药理学通报，2012，28（8）：1159－63.

［13］Wang P，Zhang J X，Li L F，et al.Effects of hydrogen sulfide on pulmonary apoptosis induced by lipopolysaccharide in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（8）：1159－63.

［14］谢英花，马燕山，张 楠，张建新.硫化氢对离体大鼠急性缺血心肌心功能的影响［J］.中国药理学通报，2014，30（7）：1000－6.

［14］Xie Y H，Ma Y S，Zhang N，Zhang JX.Effects of hydrogen sulfied on cardiac function induced by acute myocardial ischemia in isolated hearts of rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2014，30（7）：1000－6.