hi FGF2真核表达载体的构建及其高表达对细胞凋亡的影响

陈钟琳，姜红岩，洪晓冰，陈中华，郑燕珊，徐 涵，石刚刚，黄展勤

（1.汕头大学医学院附属肿瘤医院，2.汕头大学医学院药理学教研室，广东汕头 515041）

成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor-2，FGF-2），也称作碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），广泛参与细胞的生长、分化、迁移、血管生成及肿瘤的发生等过程。FGF-2基因定位于人类染色体的4q26，全长38kb，含有3个外显子和2个内含子。由于其mRNA有多个翻译起始位点，可以产生18 ku的低分子量亚型（lo FGF2）和23 ku的高分子量亚型（hi FGF2），低分子量亚型在细胞质和细胞膜中表达，高分子量亚型则主要直接进入细胞核中发挥作用。具有活性的FGF-2可通过肝素硫酸盐蛋白多糖（heparin sulfate proteoglycans，HSPG），与酪氨酸激酶受体性质的成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）结合，激活 PKC、Ras／Raf／MEK／ERK、P13K、JAK／STAT等信号传导通路，参与调节细胞增殖，分化和恶性转化［1－2］。

在心血管系统，有研究结果证明FGF-2参与了压力负荷和血管紧张素引起的心肌肥厚［3］；AngⅡ与受体结合刺激心肌细胞和心肌成纤维细胞分泌FGF-2，并激活MAPK信号通路导致心肌肥厚，心脏功能恶化［4－5］。但是，也有研究表明 FGF-2可以引起细胞染色质浓缩，抑制增殖和引起细胞凋亡［6］。显然，FGF-2在心血管中的作用尚不完全明了。

为了进一步研究hi FGF2的生物学意义及其机制，本实验构建 hi FGF2的真核表达载体，并在HEK293细胞中过表达后，观察其对HEK293细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 重组质粒hi FGF2（23 ku）-pD-sRed1-N1（由德国 Hannover大学 Prof.Dr.Peter Claus馈赠），HEK293细胞株（中国细胞库），LipofectamineTM2000 Reagent（Invitrogen公司），E.coli Trans1-T1感受态细胞（北京全式金公司），Nhel限制性内切酶、EcoRI限制性内切酶（美津生物技术公司），胶回收试剂盒（天根生物技术公司），质粒小提／中提试剂盒（BIOMIGA公司），高糖DMEM培养液、胎牛血清（HyClone公司），Annexin V-FITC／PI双染法细胞凋亡检测试剂盒（Mbchem公司），兔抗大鼠FGF-2单克隆抗体（Epitomics公司）。

1.2 实验分组 实验分成3组：正常组（Control）、转染空载体（Vector）组、转染质粒（hi FGF2）组。

1.3 pDsRed1-N1真核表达载体的构建 质粒FGF2（23 ku）-pDsRed1-N1的 cDNA用 Nhel和 Eco-RI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳后根据载体DNA片段大小切胶（约4 700 bp），用胶回收试剂盒回收纯化所切片段，得到少量载体DNA。载体DNA用感受态细胞Trans1-T1进行转化，在LB固体培养基中扩增长出菌落，最后用去内毒素质粒小提试剂盒抽提纯化出质粒DNA，即构建出pDsRed1-N1真核表达载体。用Nhel和EcoRI进行酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳。

1.4 FGF2在HEK293细胞中的转染 200 ml的DMEM（无血清）中加入4.0μg DNA，柔和混匀；200 μl／孔无血清 DMEM稀释10μl／孔 lipofectamin 2000试剂，轻轻混匀，室温放置5 min；将稀释好的DNA和lipofectamin 2000试剂轻柔混匀，室温放置20 min。将400μl上述复合物加入到细胞中，细胞在37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h后可通过倒置荧光显微镜观察到荧光，检测转染效率。

1.5 FGF2在HEK293细胞中过表达后的检测FGF2在HEK293细胞中转染48 h内提取总蛋白进行Western blot检测。一抗为兔抗FGF2单克隆抗体，二抗为羊抗兔多克隆抗体，化学发光液为底物。

1.6 检测过表达hi FGF2后细胞凋亡 用Annexin V-FITC／PI双染法细胞凋亡试剂盒检测过表达hi FGF2后细胞凋亡的情况。pDsRed1-N1-hi FGF2质粒转染至HEK293细胞后24 h，用不含EDTA的胰酶消化收集，用冷PBS洗涤细胞两次，每次2 000 r·min－1，5 min离心收集细胞；用400μl 1×Binding Buffer悬浮细胞；在细胞悬液中加入5μl Annexin VFITC，轻轻混匀避光孵育15 min；加入10μl PI后轻轻混匀避光孵育5 min；1 h内用荧光显微镜检测。细胞分组：阴性组，单染FITC组，单染 PI组，双染FITC-PI组。

1.7 统计学方法 实验结果用SPSS 13.0统计软件分析，结果以±s表示，采用单因素方差分析进行组间比较。

2 结果

2.1 HI FGF2的鉴定及真核表达载体的构建HEK293细胞RNA经逆转录聚合酶链反应法得到约1 000 bp的DNA条带，酶切克隆至pDsRed1-N1中，PCR扩增hi FGF2质粒在23 ku的基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测得到含hi FGF2 cDNA的真核表达载体，条带指示约在5500 bp和90 bp（Fig1）。DNA测序证实其全长开放读码框与真核表达载体的读码框吻合，得到pDsRed1-N1-hi FGF2。

Fig 1 hi FGF2 plasmid and p DsRed1-N1 vector was detected by gel Agarose gel electrophoresis1：The hi FGF2-pDsRed1-N1 DNA，the bands are about 5 500bp and 90bp.2，3：The pDsRed1-N1 DNA，the band is about 5 000 bp.

2.2 荧光倒置显微镜观测HI FGF2的转染效率由于目的基因片段插入载体pDsRed1-N1中，且带红色荧光蛋白，所以进行质粒hi-FGF2-pDsRed1-N1转染后，有质粒转入的细胞在荧光倒置显微镜下可观测到红色荧光，从而判断质粒的转染效率（Fig 2）。

Fig 2 Transfection of hi FGF2-pDsRed1-N1 in HEK293 cellsThe red fluorescence represents that hi FGF2-pDsRed1-N1 has been transfected into the HEK293 cells.

2.3 Western blot检测HI FGF2在HEK293细胞中的表达 Westerm blot检测pDsRed1-N1-hi FGF2转染的HEK293细胞中hi FGF2的表达，在约50 ku处出现了特异性免疫反应条带（Fig 3），而未经转染细胞对照无相应条带，表明 hi FGF2成功转入HEK293细胞中，并表达hi FGF2重组蛋白。

Fig 3 Over-expression of hi FGF2-pDsRed1-N1 in HEK293 cells1：Nomal cultured HEK293 cells；2：HEK293 cells which were transfected with hi FGF2-pDsRed1-N1.

2.4 表达HI FGF2引起细胞凋亡 FITC-Annexin V／PI双染法检测细胞凋亡。在流式细胞散点分析图上划十字门，正常细胞FITC及PI均低染（FITCPI－），图上显示为左下区细胞簇；早期凋亡细胞FITC高染而PI低染（FITC＋PI－），图上显示为右下区细胞簇；晚期凋亡及死亡细胞FITC及PI均高染（FITC＋PI＋），图上显示为右上区细胞簇（Fig 4 A，B，C）。比较早期凋亡和晚期凋亡，空载体转染组（Vector组）（Fig 4B）比正常未转染组（Control组）（Fig 4A）凋亡细胞增多，其差别有统计学意义（P＜0.05），质粒转染组（Fig 4C）比正常未转染组和空载体转染组细胞凋亡明显增多，差异均有统计学意义（P＜0.05）。说明当过表达质粒 pDsRed1-N1-hi FGF2时，明显促进细胞凋亡。

Fig 4 Over-expression of Hi-FGF2 induced cell apoptosisA：Normal cultured HEK293 cells（Control）；B：HEK293 cells which were transfected with empty vector pDsRed1-N1（Vector）；C：HEK293 cells which were transfected with hi FGF2-pDsRed1-N1（hi FGF2）.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05 vs vector

3 讨论

HEK293细胞是一种来源于人体肾脏的细胞株，且比较容易转染，是一个很常用的研究表达外源基因的细胞株。综合大量的文献和前期研究，选择HEK293细胞株作为初步研究转染和生物活性的功能性细胞，是一个最佳选择［7］。本实验选用HEK293细胞株作为实验载体，并成功进行 pD-sRed1-N1-hi FGF2的转染，为研究hi FGF2的生物学功能奠定基础。

已有研究表明，hi FGF2过表达会使半胱氨酸天冬氨酸蛋白激酶3（caspase-3）活化，同时下调Akt磷酸化水平。Miyamoto等［8］指出，多种病理损伤，包括缺血和再灌注、压力超负荷、缺氧、低血糖和心脏毒性药物能够激活Akt，阻止心肌细胞凋亡。Akt磷酸化水平一旦降低，其促细胞存活的作用也将随之降低，加上执行caspase-3的激活，标志细胞凋亡的引发［9］。本实验结果证实 hi FGF2转染到HEK293细胞过表达后会导致细胞凋亡。

本实验重组质粒hi FGF2-pDsRed1-N1的成功构建，为我们的下一步深入研究提供有利的实验条件。在本实验结果基础上，我们将进一步扩展研究hi FGF2导致细胞凋亡可能的作用机制，如对细胞中Akt磷酸化水平的影响，以及B23、p68、C1QBP等多种蛋白质的相互作用后所产生的生物效应。

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