高效液相色谱法同时测定板蓝根药材中5种成分的含量*

肖平,陈建伟,李祥,李进

(南京中医药大学药学院,南京 210023)

·药物制剂与药品质量控制·

高效液相色谱法同时测定板蓝根药材中5种成分的含量*

肖平,陈建伟,李祥,李进

(南京中医药大学药学院,南京 210023)

目的 建立高效液相色谱法同时测定板蓝根药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春5种成分的含量。方法Hanbon Hedera C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相乙腈(A)-水(B),线性梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1;检测波长254 nm,柱温30℃。结果尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春的线性范围分别为1.97～39.40 mg·L-1(r=0.999 9),1.25～50.00 mg·L-1(r=0.999 9),0.25～10.40 mg·L-1(r=0.999 6),2.84～56.70 mg·L-1(r=0.999 9),0.72～28.80 mg·L-1(r=0.999 8);平均回收率分别为99.36%(RSD=0.91%),99.79% (RSD=1.12%),100.90%(RSD=1.71%),98.67%(RSD=1.50%),99.33%(RSD=0.94%)。结论该方法简便,重复性好,灵敏度高,结果准确可靠,可作为板蓝根质量控制的有效方法。

板蓝根;核苷;告依春;色谱法,高效液相;含量测定

板蓝根为十字花科植物菘蓝(Isatis indigoticaFort.)的干燥根,具有清热解毒、凉血利咽等功效[1],临床上常用于病毒及细菌感染性疾病,尤其在抗病毒方面疗效确切[2]。板蓝根含有生物碱、有机酸、苯丙素、氨基酸、核苷等成分[3]。(R,S)-告依春为板蓝根中的抗病毒活性成分之一,2010年版《中华人民共和国药典》采用反相高效液相色谱(reverse phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)法测定板蓝根中(R,S)-告依春的含量并对其进行质量控制[1-4]。核苷类成分大多具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤、提高免疫力等活性,是板蓝根中抗病毒的有效部位之一[5-6]。近年来高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法测定板蓝根及其制剂中(R,S)-告依春、腺苷、尿苷、鸟苷含量的文献报道较多[7-9],但笔者未见对板蓝根药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、胸腺嘧啶进行含量测定的报道。本研究首次采用HPLC同时测定10批次板蓝根药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春含量,以期为板蓝根的质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1200 HPLC配G1315D型DAD检测器(美国Agilent公司),电子天平(SHIMADZU,AY-220型)。

1.2 试药 尿嘧啶对照品(批号:20331-201207,纯度: 99.8%)、次黄嘌呤对照品(批号:20333-201205,纯度: 98.7%)、鸟苷对照品(批号:20332-201205,纯度: 98.9%)、胸腺嘧啶对照品(批号:20330-201209,纯度: 99.9%)均购自南昌贝塔生物技术有限公司。(R,S)-告依春对照品(批号:10122601,纯度:99.5%)购自扬子江药业集团南京海陵药业有限公司。各对照品经HPLC法检测纯度均>98%。乙腈(MERCK公司,色谱纯,批号:1102374),水为超纯水(由Millipore纯水器制得),其他试剂均为分析纯。板蓝根药材采集于全国各地,经南京中医药大学生药学教研室陈建伟教授鉴定为十字花科植物菘蓝(Isatis indigoticaFort.)的干燥根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Hanbon Hedera C18色谱柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-水(B),线性梯度洗脱,0～6 min,100%B,～25 min,100%B→90%B,～29 min,90%B→75%B;流速:1.0 mL·min-1;检测波长254 nm;柱温30℃;进样量10 μL。根据液相色谱保留时间和紫外光谱信息对5种成分进行指认,各色谱峰的峰形及分离度较好,结果见图1[10]。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取于干燥器中放置>24 h的尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春对照品适量,精密称定,加水配成浓度分别为394.0,250. 0,104.0,1 134.0,144.0 mg·L-1的对照品储备液。分别移取一定体积的上述对照品储备液于量瓶定容,配成含尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春浓度分别为78.8,50.0,10.4,113.4,28.8 mg·L-1的混合储备溶液,备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 参照2010年版《中华人民共和国药典》方法,并稍作调整,取板蓝根药材粉末(过4号筛,筛孔内径250 μm)约1 g,精密称定,置圆底烧瓶中,精密加入纯化水50 mL,称定质量,连续回流提取2 h后放冷,再称定质量,用水补足减少的质量。摇匀,取上清液适量过孔径0.45 μm微孔滤膜,取续滤液作为供试品溶液[1]。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 取尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春混合对照品储备溶液,按不同比例加水稀释成7个不同浓度,按含量测定方法测定。以对照品质量浓度(mg·L-1)为横坐标(X),以相应对照品峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归,得线性回归方程及相关系数。将上述混合对照品溶液进行逐级稀释,进样分析,以信噪比(S/N)约为10计定量限,以S/N约为3计检出限,线性回归参数、检测限、定量限结果见表1。

A.对照品;B.样品;1.尿嘧啶;2.次黄嘌呤;3.鸟苷;4.胸腺嘧啶;5.(R,S)-告依春图1 对照品和样品的HPLC图A.reference substances;B.Sample;1.uracil;2.hypoxanthine; 3.guanosine;4.thymine 5.(R,S)-goitrinFig.1 HPLC chromatograms of reference substances and sample

2.3.2 精密度实验 取同一混合对照品溶液在上述色谱条件下连续进样6次,尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春峰面积的RSD(n=6)分别为0.4%, 0.4%,2.0%,0.1%,0.2%,表明该仪器精密度良好。

2.3.3 重复性实验 取同一批板蓝根药材粉末(S2)按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法平行处理6份,进行测定,以峰面积外标法计算含量,尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春的含量分别为0.45,0.54,0.06,0.01,0.20 mg·g-1,RSD(n=6)分别为0.5%,2.5%,1.9%,2.3%,2.6%,结果表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性实验 取同一批次板蓝根药材粉末,按“2.2.2”项供试品溶液制备方法操作,制备供试品溶液,分别在0,2,4,6,8,12,24 h进样分析,测得尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春含量的RSD(n=7)分别为0.3%,1.1%,2.3%,2.1%,1.8%,表明供试品溶液室温放置24 h内稳定。

表1 5种成分的回归方程、相关系数、线性范围、定量限和检出限Tab.1 Regression equations,correlation coefficients(r),linear ranges,limits of quantification(LOQ)and limits of detection (LOD)of five compounds

2.3.5 加样回收率实验 精密称取同批次已知含量的板蓝根药材粉末(S10)约0.2 g,共6份,每份按一定比例加入适量尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春对照品储备液,按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备,按“2.1”项色谱条件进样分析,计算回收率结果,见表2。

表2 5成分加样回收率实验结果Tab.2 Recoveries of five compounds n=6

2.4 样品测定 取不同批次板蓝根药材粉末,按“2.2.2”项供试品溶液制备方法制备样品,按“2.1”项色谱条件进行含量测定,计算各批次药材不同成分的平均含量(n=3),结果见表3。

表3 不同产地板蓝根5种成分含量测定结果Tab.3 Contents of five compounds in Radix Isatidis from different districts n=3,mg·g-1

3 讨论

3.1 供试品溶液配制方法的选择 本实验选用水和80%甲醇作为提取溶剂进行提取,比较发现水提取效率较高且对人体无毒害,故选择水作为提取溶剂。比较了煎煮、回流提取与超声提取3种提取方法,发现回流提取效率优于其他两种提取方法,且可以减少提取溶剂的损失。在此基础上,考察了回流提取时间对实验结果的影响,结果表明采用水连续回流提取2 h后5种成分基本提取完全。

3.2 高效液相色谱条件的建立 《中华人民共和国药典》2010年版中板蓝根的指标性成分是(R,S)-告依春,检测波长为245 nm,在200～400 nm范围内用二极管阵列检测器对样品进行全波长扫描,5种成分的最大吸收波长在240～265 nm范围内,在254 nm处色谱峰数较多,且所测成分的响应值较大,综合考虑选择254 nm作为检测波长。在流动相系统的选择中,试用了甲醇-0.02%磷酸溶液、甲醇-水-0.2%甲酸、水-乙腈3种流动相系统,结果表明采用水-乙腈系统时分离度较好。由于所测的成分极性较大,起始时较大比例的乙腈造成出峰时间过于提前,经摸索后确定选用水-乙腈系统梯度洗脱,5种成分分离效果较好,可避免使用缓冲盐作为流动相造成色谱柱的损害,延长色谱柱使用寿命。

3.3 含量测定结果分析 《中华人民共和国药典》2010年版中规定(R,S)-告依春含量不得低于0.020%,10批次药材中产于安徽和四川绵阳的板蓝根(R,S)-告依春含量分别为0.012%,0.013%,低于《中华人民共和国药典》(2010年版)标准,其他批次药材均符合标准。从5种成分总量来看,产自甘肃河西(S3)的板蓝根含量最高,而同产自于甘肃的S4样品的总含量最低。10批次板蓝根中胸腺嘧啶含量普遍都较低,产自于内蒙古赤峰的板蓝根中尿嘧啶和次黄嘌呤的含量均最高,而产自甘肃的S4样品中尿嘧啶和次黄嘌呤含量最低。不同批次板蓝根药材中各成分的含量差异性较大,即使同一产地的板蓝根药材中核苷类成分含量差异也较大。

本实验首次采用高效液相法同时测定板蓝根药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春的含量。该方法简便,测定结果准确、可靠,重复性较好,可用于板蓝根药材及其制剂的质量控制。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.023

Simultaneous Determination of Five Compounds in Isatidis Radix by HPLC

XIAO Ping,CHEN Jian-wei,LI Xiang,LI Jin
(College of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023,China)

ObjectiveTo establish a HPLC method for simultaneous determination of uracil,hypoxanthine,guanosine, thymine,and(R,S)-goitrin inIsatidis Radix.MethodsThe determination was performed on a Hanbon Hedera C18column (4.6 mm×250 mm,5 μm).The mobile phase consisted of acetonitrile(A)and water(B)with linear gradient elution at the flow rate of 1.0 mL·min-1.The column temperature was 30℃.Detection wavelength was 254 nm.ResultsThe linear range of uracil,hypoxanthine,guanosine,thymine,and(R,S)-goitrin was 1.97-39.40 mg·L-1(r=0.999 9),1.25-50.00 mg·L-1(r= 0.999 9),0.25-10.40 mg·L-1(r=0.999 6),2.84-56.70 mg·L-1(r=0.999 9),and 0.72-28.80 mg·L-1(r=0.999 8), respectively.The average recovery was 99.36%(RSD=0.91%),99.79%(RSD=1.12%),100.90%(RSD=1.71%),98.67% (RSD=1.50%),and 99.33%(RSD=0.94%),respectively.ConclusionThe method is simple,accurate,reliable,reproducible and sensitive,which can be used as an effective method for quality control ofIsatidis Radix.

Isatidis Radix;Nucleosides;(R,S)-goitrin;HPLC;Content determination

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)11-1481-05

2013-10-25

2013-11-22

*国家自然科学基金资助项目(81073023);江苏省产学研联合创新奖金项(BY2009109);南京中医药大学“康缘中医药科技创新基金”项目(HZ0808KY);江苏高校优势学科建设工程资助项目(YSXK-2010);江苏省2013年度普通高校研究生科研创新计划项目(CXZZ13_06)

肖平(1987-),男,湖南衡阳人,在读博士,主要从事中药质量标准、药效物质基础研究。电话:025-85811512, E-mail:pingxiao58@126.com。

李祥(1953-),女,教授,博士生导师,从事中药药效物质基础研究。电话:025-85811512,E-mail:lixiang_8182 @163.com。