高效液相色谱法测定接骨木茎叶果实中芦丁的含量*

胡彦武,关颖丽,张立威,王朝辉

(1.通化师范学院吉林省长白山药用植物研究重点实验室,通化 134002；2.通化师范学院制药与食品科学学院,通化 134002；3.长春中医药大学针灸推拿学院,长春 130117)

高效液相色谱法测定接骨木茎叶果实中芦丁的含量*

胡彦武1,2,关颖丽1,2,张立威2,王朝辉3

(1.通化师范学院吉林省长白山药用植物研究重点实验室,通化 134002；2.通化师范学院制药与食品科学学院,通化 134002；3.长春中医药大学针灸推拿学院,长春 130117)

目的 测定接骨木茎、叶、果实等不同部位中芦丁的含量,为接骨木资源的合理开发和综合利用提供依据。方法采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱,甲醇-0.1%磷酸水溶液(45∶55),柱温25℃,流速为0.8 mL·min-1,检测波长为360 nm。结果芦丁在0.105～0.525 μg范围内呈良好的线性关系(r= 0.999 6),平均回收率97.86%,RSD=0.49%。测得接骨木茎、叶、果实中芦丁含量分别为0.171,0.522,0.165 mg·g-1。结论接骨木茎、叶、果实中均含有芦丁,但差异较大,以叶中芦丁含量最高。

接骨木;芦丁;色谱法,高效液相

接骨木(Sambucus williamsiiHance)为忍冬科接骨木属植物,收载于《本草纲目》中,别名马尿骚、公道老、续骨草,其野生资源丰富,广泛分布于我国东北、华北、西北、西南等地,具有祛风利湿、舒筋活血之功效,民间多用于风湿性关节炎、骨折、跌打损伤、痛风、大骨节病、水肿、荨麻疹等疾病的治疗。而有关接骨木的确切入药部位,说法不一,有资料记载接骨木以茎、叶入药[1],亦有资料称其全株皆可入药[2]。目前国内学者已对接骨木抗炎、促进骨折愈合等药理作用进行报道,但与其功效相关的物质成分,笔者未见详实报道。考虑到忍冬科其他植物中黄酮类成分含量较高,为此,本实验以长白山区野生接骨木茎、叶、果实等不同部位为实验材料,采用超声提取法对其所含芦丁成分进行提取,并以高效液相色谱(HPLC)法进行含量测定,以期了解接骨木不同药用部位中芦丁的含量差异,为探析接骨木中黄酮类成分的含量、筛选接骨木最佳入药部位、深入研究接骨木中与功效相关的物质基础提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪(四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、紫外检测器)；KQ-200KDB型高功率数控超声波清洗机(昆山市超声波仪器有限公司)；Sartorius-CP225D型电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)。

1.2 试药 接骨木茎、叶、果实均采自通化师范学院后山(长白山余脉),经通化师范学院制药与食品科学学院于俊林教授鉴定为忍冬科接骨木属植物接骨木(Sambucus williamsii)的干燥茎、叶及成熟果实；芦丁对照品(中国食品药品检定研究院,批号:1097-060918)；甲醇为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司,批号:20090817),磷酸为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司,批号:20110721),水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司,批号:20121030)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱；流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液(45∶55)；检测波长为360 nm；流速0.8 mL·min-1；柱温25℃；理论板数以芦丁峰计算应不低于2 000。

2.2 对照品溶液制备 取120℃干燥至恒重的芦丁对照品5.25 mg,精密称定,置于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容,摇匀,即得质量浓度为0.525 g·L-1的芦丁对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备 取干燥接骨木茎、叶、果实粉末(过孔径0.425 mm筛)各约1.0 g,精密称定,分别置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇20 mL,浸泡30 min,称定质量,温度45℃、超声功率100 W、频率40 kHz条件下超声处理20 min,放冷,再称定质量,用甲醇补足减轻的质量,摇匀,经孔径0.45 μm微孔滤膜滤过,弃初滤液,取续滤液,即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取“2.2”项对照品溶液1 mL,置于25 mL量瓶中,甲醇定容,摇匀,吸取稀释后的标准品溶液5,10,15,20,25 μL,在“2.1”项色谱条件下进样并测定峰面积,并以对照品进样量为横坐标(X),峰面积积分值(Y)为纵坐标,进行线性回归[3-5],得回归方程为Y=2 011.80X-254.80,r= 0.999 6,结果表明芦丁对照品进样量在0.105～0.525 μg范围内线性关系良好。

2.4.2 精密度实验 精密吸取“2.2”项对照品溶液20 μL,在“2.1”项下色谱条件下进样,连续进样6次,并测定芦丁色谱峰面积,结果RSD为1.31%,提示仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性实验 精密吸取“2.3”项下同一供试品溶液(接骨木茎)20 μL,在“2.1”项色谱条件下进样,分别在0,2,4,6,8,24 h进样,记录芦丁色谱峰面积,结果RSD为1.08%,表明供试品溶液中芦丁在24 h内稳定。

2.4.4 重复性实验 取同一供试品(接骨木茎),按“2.3”项方法制备供试品溶液,平行操作6份,按“2.1”项色谱条件测定芦丁含量,结果RSD为1.10%,表明方法的重复性良好。

2.4.5 加样回收率实验 取同一已知芦丁含量供试品(接骨木茎,芦丁含量为0.171 mg·g-1)6份,每份约0.5 g,精密称定,分别加入一定量的芦丁对照品溶液(约为样品中芦丁含量的1.0倍量),按“2.3”项方法制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样,每次进样20 μL,对芦丁进行分析,计算加样回收率,结果见表1。芦丁平均回收率为97.86%,RSD为0.49%,表明芦丁的加样回收率良好。

表1 芦丁加样回收率实验结果Tab.1 Recovery results of rutin n=6

2.5 样品含量测定 取接骨木茎、叶、果实粉末各约1.0 g,精密称定,同一样品平行操作3份,按“2.3”项方法制备样品溶液,在“2.1”项色谱条件下进行检测,接骨木茎、叶、果实中芦丁的含量分别为0.171, 0.522,0.165 mg·g-1,RSD分别为1.14%,1.09%, 1.11%。

3 讨论

本实验采用超声提取法首次对接骨木茎、叶、果实中芦丁进行提取,参照《中华人民共和国药典》2010年版中芦丁的定量检测方法,并结合预实验,针对待测组分与其他组分分离情况及保留时间两项指标,对HPLC测定芦丁的测定条件进行了摸索,最后将色谱条件确定为:流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液(45∶55),流速为0.8 mL·min-1,检测波长360 nm,柱温25℃。

通过本实验研究得知,接骨木叶、茎、果实均含有芦丁,以叶中芦丁含量最高,其次为茎,果实中芦丁含量较少,如以芦丁作为质量评价依据,应主要以茎叶为接骨木的入药部位。本研究结果印证了此前有资料报道的以接骨木茎、叶为入药部位的观点,进而提示,接骨木中含有的黄酮类成分可能是与祛风利湿、舒筋活血等功效相关的重要物质基础。

[1] 严仲铠,李万林,刘桂荣,等.中国长白山药用植物彩色图志[M].北京:人民卫生出版社,1997:394.

[2] 南京中医药大学.中药大辞典[M].2版.上海:上海科学技术出版社,2006:2093.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:333.

[4] 耿旦,马雯芳,甄汉深,等.RP-HPLC测定桑椹中芦丁的含量[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(14):63-65.

[5] 李利华.HPLC测定鱼腥草不同部位绿原酸和芦丁的含量[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(19):94-97.

DOI 10.3870/yydb.2014.09.031

Content Determination of Rutin in Stems,Leaves,and Fruits of Sambucus williamsii Hance by HPLC

HU Yan-wu1,2,GUAN Ying-li1,2,ZHANG Li-wei2,WANG Zhao-hui3
(1.Key Laboratory of Changbai Mountain Medicinal Plants Research of Jilin,Tonghua Normal University,Tonghua 134002,China;2.College of Pharmaceutics and Food Science,Tonghua Normal University,Tonghua 134002,China;3.College of Acupuncture and Tuina,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

Objective To determine the content of rutin in fruits,stems,and leaves ofSambucus williamsiiHance,and provide an essential reference for the exploitation and utilization of the resources.MethodsThe content of rutin was analyzed on an Agilent ZORBAX Eclispse XDB C18column(150 mm×4.6 mm,5 μm).The mobile phase was methanol-0.1%phosphoric acid(45∶55),the column temperature was set at 25℃,the flow rate was 0.8 mL·min-1,and the detection wavelength was set at 360 nm.ResultsThe linear range of rutin was 0.105-0.525 μg(r=0.999 6),the average recovery was 97.86%,and RSD was 0.49%.The content of rutin in stems,leaves,and fruits ofSambucus williamsiiHance was 0.171,0.522,and 0.165 mg·g-1,respectively.ConclusionThe stems,leaves and fruits ofSambucus williamsiiHance all contain rutin,but at a significant different content level.The leaves contain the highest level of rutin.

Sambucus williamsiiHance;Rutin;Chromatography,high performance liquid

R282.71;R927.2

B

1004-0781(2014)09-1222-03

2013-10-14

2014-01-17

*吉林省教育厅“十一五”科学技术研究项目(2008374)

胡彦武(1980-),男,吉林梨树人,副教授,在读博士,研究方向:生药有效成分的分离鉴定及生物活性。电话: (0)13844545298,E-mail:hywcz@163.com。

王朝辉(1973-),女,吉林长春人,副教授,硕士生导师,博士,研究方向:中医基础及中药新药。电话:0431-86045460,E-mail:wzhqiwei@126.com。