连作烟田土壤根系分泌物的变化和分解

于会泳，申国明，高欣欣,2



连作烟田土壤根系分泌物的变化和分解

于会泳1，申国明1，高欣欣1,2

（1.中国农业科学院烟草研究所，农业部烟草生物学与加工重点实验室，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

为阐明烟田土壤中根系分泌物的变化规律及确定具有化感作用的根系分泌物种类，研究分析了种烟1年、连作2年和连作3年0~20 cm、20~40 cm烟田土壤中根系分泌物的含量变化，并通过室内试验研究了烟草根系分泌物的分解转化。结果表明：（1）烟田土壤中含量较高的根系分泌物种类有苯甲酸、4-羟基苯乙酸、3-甲氧基-4-羟基苯乙酸和邻苯二甲酸二辛酯，其中4-羟基苯乙酸含量最高，含量较低的种类有4-羟基丁酸和甘油；（2）羟基丁酸、3-甲基-2-羟基丁酸、4-羟基丁酸、肉桂酸、油酸、硬脂酸酰胺和烟碱对烟草无直接化感作用；（3）室内试验表明，肉桂酸、3-甲氧基-4-羟基苯乙酸、邻苯二甲酸、3-羟基苯甲酸、邻苯二甲酸二辛酯、4-羟基苯乙酸和肉豆蔻酸的分解转化率均小于50%；（4）初步判定具有化感作用的根系分泌物种类包括：苯甲酸、3-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、月桂酸、邻苯二甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯乙酸、3,4-二羟基苯甲酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、9,12-十八碳二烯酸、苯丙酸、东良菪素、肉桂酸、邻苯二甲酸二辛酯和4-羟基苯乙酸。

烟草；土壤；化感物质；分解转化

化感物质几乎全为植物的次生代谢物质，主要种类有简单不饱和脂肪酸、长链脂肪酸和多炔、醌类、苯甲酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、香豆素类、类黄酮类、单宁、内萜、氨基酸和多肽、生物碱和氰醇、硫化物和芥子油苷、嘌呤和核苷等14类，其中低分子量有机酸、酚类和萜类化合物最为常见，其在植物体内的合成途径模型由Rice[1]最早得出，Birkett等[2]对一些化感物质进入根际的途径进行了详细阐述。化感物质对作物生理[3-8]、土壤理化性质[9-11]具有重要影响。化感效应在一定的浓度基础上才能表现出来，自然状态下根系分泌物的化感物质含量极少，不足以发挥化感效应[2]。根系分泌的化感物质首先进入根际土壤，随土壤水分进行迁移，受土壤质地、粒径结构及有机质等多种因素影响，在土壤中的行为极其复杂，包括吸附解析过程、转化和降解与滞留过程。孔垂华等[12]发现胜红蓟产生的重要化感物质胜红蓟素的转化与土壤营养水平显著相关，在营养条件好的土壤中首先聚合成二聚体，26 d后解聚为胜红蓟素，然后降解为无活性的小分子物质，在低营养水平的土壤中直接降解为小分子物质。

烟草根系分泌物中的化感物质被认为是造成连作障碍的重要原因[13-15]。研究烟田土壤中根系分泌物的分布与转化规律有助于阐明化感物质种类。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

供试土壤于2011年10月中旬采自于山东省日照市五莲县于里镇现代烟草农业科技示范园“山东基本烟田综合治理”项目土壤质量长期定位监测点，土壤类型为潮棕壤。烟草根系分泌物降解研究取连作3年0~20 cm耕层土壤进行试验；不同连作年限烟田土壤根系分泌物变化研究试验所用土壤为种烟1年、连作2年和连作3年的0~20 cm、20~40 cm土壤。

取样方法：在烟叶收获后，用土钻在相应的处理地块中沿“S”形多点取样，每个样品取土约2 kg，在实验室用四分法分取，所得土壤样品经处理后待用。土壤基础理化性质如表1。

1.2 方法

1.2.1 烟草根系分泌物降解试验土壤处理方法 捡除新鲜土壤中的石块和植物残体，过2 mm筛，调节含水量，达到手感湿润但不结块，混匀，此时土壤含水量约为饱和持水量的40%。取处理好的鲜土1 kg，放置于25 ℃、黑暗环境中，放置1小杯1 mol/L NaOH溶液用于吸收土壤呼吸释放的CO2，1小杯水用于保持土壤湿度，3次重复，每3 d取样1次，每次取25 g，共取5次，即检测土壤15 d内根系分泌物的含量变化，其中取处理好的土壤25 g做为初始样品。

1.2.2 土壤根系分泌物检测方法 取25 g鲜土置于50 mL离心管中，3次重复，加入25 mL、1 mol/L NaOH放置过夜，次日180 r/min振荡30 min，用高速离心机（6000 r/min）对振荡液进行离心7 min，过滤液用12 mol/L的HCl酸化至pH 2.5，2 h后用高速离心机（6000 r/min、7 min）除去胡敏酸，而后上清液过0.22 μm的纤维素薄膜，滤液用Agilent 1290—6430超高压液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪进行检测。其中烟碱采用正离子模式进行检测，其他物质采用负离子模式进行检测。

1.2.3 检测条件 仪器：Agilent 1290—6430超高压液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪。色谱条件：色谱柱ACQUITY UPLC®HSS T3（2.1 mm×150 mm×1.8 µm）；流动相：A为5%乙腈·H2O；B为乙腈；流速0.2 mL/min；柱温25 ℃；进样体积10 µL，梯度洗脱条件见表2。MS条件：离子源ESI，扫描范围50~500 m/z；毛细管电压：正离子模式4 KV，负离子模式-4 KV；干燥气温度350 ℃；干燥气流速10 L/min；雾化气压力40 psi。

表1 供试土壤理化性质

表2 梯度洗脱条件

1.2.4 数据分析 采用SAS 9.1.3进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 不同连作年限烟田土壤根系分泌物的含量变化

表3为不同连作年限烟田0~20 cm和20~40 cm土壤根系分泌物的含量变化，从中可看出：（1）不同连作年限的土壤中不包含2-羟基丙酸和硬脂酸；（2）烟田土壤中含量较高的根系分泌物种类包括苯甲酸、4-羟基苯乙酸、3-甲氧基-4-羟基苯乙酸和邻苯二甲酸二辛酯，其中4-羟基苯乙酸含量最高；含量较低的种类有4-羟基丁酸和甘油；（3）0~20 cm耕层土壤中随着连作年限增加而增加的根系分泌物种类有：苯甲酸、硬脂酸酰胺和邻苯二甲酸二丁酯，其中苯甲酸在20~40 cm也随连作年限的增加而增加。烟草随着连作年限增加所受到的不良影响越大[16]，所以苯甲酸很可能为随着浓度增加而对烟草产生不良影响的化感物质。苯甲酸和肉桂酸以及水杨酸也已在番茄、辣椒、西瓜、甜瓜和杨树的根系分泌物中被鉴定出来具有化感作用，通过影响离子吸收、水分吸收、光合作用、蛋白质和DNA合成等多种途径影响作物生长[17-19]。（4）羟基丁酸、丁二酸、油酸、硬脂酸酰胺和3-甲氧基-4-羟基苯乙酸含量在0~20 cm和20~40 cm的土壤中以连作2年最高；4-羟基苯乙酸的含量连作2年最低；3-甲基-2-羟基丁酸、肉桂酸含量在0~20 cm土壤中以连作2年最高，在0~40 cm土壤中的含量随连作年限增加而减少，因为随着连作年限的增加，烟草连作障碍越严重，直接产生化感作用的物质含量应越来越高，所以排除这几种物质是直接起化感作用的物质。（5）烟碱含量是采用正离子模式检测的，含量无法与其他物质进行对比，连作2年的土壤烟碱含量较第1年种烟与连作3年低，排除其作为直接化感物质的可能性。

表3 不同连作年限烟田土壤根系分泌物的含量变化

Table 3 The Variation in contents of root exudates in different tobacco planting systems

注：表中数据无单位，为粒子流强度，是波面积的积分，代表物质含量大小。表4同。

2.2 烟草根系分泌物的分解转化

为了进一步确定烟草根系分泌物中的化感物质种类，通过室内实验，研究了根系分泌物的分解转化。表4为经培养0、3、6、9、12、15 d后根系分泌物的含量变化。可看出经培养15 d后，所有根系分泌物均被不同程度分解转化，其中甘油完全被分解转化，NC89与K326共有的根系分泌物2-羟基丙酸和硬脂酸在本试验中未被检测到，所以排除这3种物质作为化感物质的可能性；丁二酸是三羧酸循环中一种有机酸，不是化感物质；其他种类的分解转化率为24.6%～79.5%，超过50%的13种，其中肉桂酸最低，油酸最高。

表4 烟草根系分泌物的分解转化

注：同一物质不同时间数据间均呈显著性差异（<0.5）。

化感效应的发挥必须建立在一定浓度基础之上，从浓度的角度可认为越易分解转化的物质作为化感物质的可能性越小。根系分泌物中分解转化率超过70%的种类有油酸、硬脂酸酰胺、烟碱，认为它们是化感物质的可能性小，烟草根系分泌物分解转化率小于50%的种类有肉桂酸、3-甲氧基-4-羟基苯乙酸、邻苯二甲酸、3-羟基苯甲酸、邻苯二甲酸二辛酯、4-羟基苯乙酸和肉豆蔻酸，认为它们是化感物质的可能性大。

各种物质分解转化规律不同，其中第3~6天转化较快的根系分泌物种类包括9，12-十八碳二烯酸、硬脂酸酰胺和己二酸二辛酯；邻苯二甲酸和邻苯二甲酸二丁酯在第9~12天分解转化较快；3-甲基-2-羟基丁酸、4-羟基苯乙酸和苯基酸在第6~9天分解转化最快。化感物质的分解转化有理化与生物学过程，根系分泌物可为土壤微生物提供营养，生物作用可能在根系分泌物的转化过程中起主要作用。本研究主要考虑了土壤生物学过程对根系分泌物分解转化的影响，其他因素如昼夜温差、土壤含水量和光照等变化对根系分泌物也有显著影响。

3 结 论

化感物质应具有累积性，因为烟草因连作年限的增加所受到的影响越大，所以化感物质在连作时间长的土壤中含量越高，化感物质也应具有不易转化性，这样才能体现出化感作用。

本研究发现，最可能对烟草具有化感作用的物质为苯甲酸；其次为3-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、月桂酸、邻苯二甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯乙酸、3,4-二羟基苯甲酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、9,12-十八碳二烯酸、邻苯二甲酸二辛酯、4-羟基苯乙酸、苯丙酸和东良菪素以及烟碱；对烟草不直接起化感作用的物质包括羟基丁酸、3-甲基-2-羟基丁酸、4-羟基丁酸、肉桂酸、油酸、硬脂酸酰胺，但不能排除他们的间接作用。

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The Changes and Degradation of Tobacco Root Exudates in Tobacco Field with Continuous Cropping

YU Huiyong1, SHEN Guoming1, GAO Xinxin1,2

(1. Tobacco Research Institute of CAAS, Key Laboratory of Tobacco Biology and Processing, Ministry of Agriculture, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081,China)

We analyzed contents of tobacco root exudates in 0-20 cm and 20-40 cm soil where tobacco had grown for 1 year, 2 years, and 3 years in order to investigate variation of exudates in tobacco field and identify allelochemicals. The results showed that the content of benzoic acid, 4-hydroxyphenylacetic acid, 3-oxygen-4-hydroxyphenylacetic acid and phthalic acid dioctyl ester in tobacco field were high, of which 4-hydroxyphenylacetic acid was the highest, and the content of 4-hydroxybutyric acid and glycerin were low. Hydroxybutyric acid, 3-methyl-2-hydroxy butyric acid, 4-hydroxybutyric acid, cinnamic acid, oleic acid, stearic acid amide and nicotine had no direct allelopathic influence to tobacco. The decomposition rates of cinnamic acid, 3-methoxy-4-hydroxyphenyl acetic acid, phthalic acid, 3-hydroxy benzoic acid, dioctyl phthalate, 4-hydroxyphenyl acetic acid and myristic acid were less than 50%. We proposed that the following acids were allelochemicals, including benzoic acid, 3-hydroxybenzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid, lauric acid, oterephthalic acid, 3-methoxy-4-hydroxyphenyl acetic acid, 3,4-dihydroxybenzoic acid, myristic acid, palmitic acid, 9,12-octadecadienoic acid, acrylic acid, scopoletin, cinnamic acid, phthalic acid dioctyl phthalate and 4 - hydroxyphenylacetic acid.

tobacco; soil; allelochemical; decomposition

S572.01

1007-5119（2014）01-0043-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.008

青岛市科技局，青岛市公共领域科技支撑计划项目“烟草根系分泌物对土壤生物学性质的影响规律研究”（12-1-3-47-nsh）；山东省烟草专卖局重大科技专项“山东基本烟田土壤综合治理研究”{鲁烟科[2010]19号}

于会泳，男，助理研究员，主要研究领域为烟草栽培。E-mail：110138406@qq.com

2012-06-15

2013-05-07