离体外翻肠囊法研究头花蓼提取物中5个成分的肠吸收特性

唐 丽，刘 跃，黄 勇，廖尚高，兰燕宇

（贵阳医学院1.民族药与中药开发应用教育部工程研究中心、2.药学院贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳 550004）

头花蓼（Polygonum capitatumBuch.-Ham.ex D.Don）属于蓼科（Polygonaceae）、蓼属（Polygonum）、头状蓼组（Cephalophilon）多年生草本植物，是贵州省别具特色的苗药资源之一。目前，头花蓼是贵州省中药现代化重点培育发展的“十大苗药”和“十大中药产业链”品种之一，收载于2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》［1］。具有清热解毒、利尿通淋之效，临床上主要用于泌尿系统感染等症的治疗。

肠外翻模型是由Wilson和Wiseman于1954年创建，最早用于研究葡萄糖和氨基酸在肠道的代谢与转运［2］，后经改进，目前成为最常用的体外肠道吸收生物模型，是一种能够快速反映药物吸收行为的体外方法。鉴于目前头花蓼的药效物质不明确，故本实验采用“简便、快速、重复性良好”的大鼠肠囊外翻模型［3－4］，应用 UPLC-MS/MS法考察头花蓼提取物中没食子酸、原儿茶酸，杨梅苷、陆地棉苷及槲皮苷5种主要成分在小肠中的吸收特性，为头花蓼的药效物质提供实验参考。

1 材料

1.1 仪器与试药超高液相色谱－三重四级杆串联质谱仪（美国Waters公司）；Allegra 64R高速离心机（美国Beckman Coulter公司）；自制麦氏浴管；混合气体（95%O2，5%CO2）；DK-98-ⅡA恒温水裕锅（天津泰斯特仪器有限公司）。

没食子酸（批号M20－101209，中药固体制剂制造技术国家工程研究中心）；原儿茶酸（批号110306）、杨梅苷（批号111018），均购自四川省维克奇生物科技有限公司；槲皮苷、陆地棉苷（贵州省药物制剂重点实验室制备，纯度≥98%）；葛根素（内标，批号0752-9605，中国药品生物制品鉴定所）；头花蓼提取物（自制，批号20130407），乙腈、甲酸为色谱纯；Tyrode缓冲液（NaCl8.0 g、KCl0.2 g、NaHCO31.0 g、NaH2PO40.05 g及MgCl20.1 g，加500ml蒸馏水溶解，0.2 g CaCl2溶于 500 ml蒸馏水，两者混匀后加入1.0 g葡萄糖即可）。

1.2 试验动物健康SD♂，体质量为（220±20）g，由贵阳医学院动物中心提供，批号：SCXK（黔）2002－0001。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱：Waters BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）柱，流动相：0.1%甲酸乙腈（A）－0.1%甲酸水（B），梯度为0～1.5 min：5% ～35%（A），1.5～3min：35%～95%（A），3～4 min：95% ～5%（A）；流速 0.35 ml·min－1；柱温 45℃，进样体积 1μl。

2.2 质谱条件电喷雾离子化（ESI），毛细管电离电压：3 kV，离子源温度120℃ ；喷雾气与反吹气：N2，去溶剂气流速：650 L/hr，去溶剂气温度：350℃，反吹气流速为 50 L/hr；扫描方式为多反应离子监测（MRM），没食子酸：m/z（－）169→125、原儿茶酸：m/z（－）152.9→109、杨梅苷：m/z（＋）465.3→319、陆地棉苷：m/z（＋）465.2→303、槲皮苷：m/z（＋）449.2→303.1及葛根素：m/z（＋）417→267。

2.3 供试药液制备取头花蓼药材（购自贵州施秉头花蓼GAP种植基地）1 000 g，加水煎煮2次，每次1.5 h，煎液滤过，合并滤液，浓缩干燥后得头花蓼提取物。没食子酸、原儿茶酸、杨梅苷、陆地棉苷及槲皮苷在提取物中的百分含量分别为：1.445%、0.042%、0.025%、0.055%、0.208%。称取头花蓼提取物适量溶解于Tyrode液中，10 000 r·min－1离心5min，配制成低、中、高浓度分别为 18.73、37.45、74.90 g·L－1的头花蓼提取物肠吸收液。

2.4 外翻肠囊实验同参考文献［5］，本实验根据其进行适当修改，将制备的肠管放入盛有10 ml 37℃恒温Tyrode液的麦氏浴管中，开始供混合气体（95%O2，5%CO2）。在肠管中注入2mlTyrode液平衡10min，将Tyrode液换成低、中、高3个浓度的含药 Tyrode液，分别在 15、20、45、60、90、120 min取样200μl，同时补充等体积的37℃Tyrode液。样品放入Eppendorf管中，－20℃保存。实验后将各肠管纵向剖开，自然摊于滤纸上测量其长度和宽度，记录吸收面积A。取肠外翻样品溶液 100μl，加 10μl、20 mg·L－1内标溶液 300μl 15%乙腈及50μl 1%的甲酸，涡混1 min，15 000 r·min－1离心5 min，取上清液进样UPLC-MS分析。

Tab 1 The K a of five ingredients of Polygonum capitatum in different concentrations at duodenum and jejunum（±s，n＝3）

Tab 1 The K a of five ingredients of Polygonum capitatum in different concentrations at duodenum and jejunum（±s，n＝3）

*P＜0．05 vs high concentration；＃P＜0．05 vs middle concentration

Group Duodenum High concentration Middle concentration Low Low concentration Gallic acid 0.618±0.845 0.438±0.043* 0.229±0.022* 0.845±0.103 0.672±0.090*0.297±0.070*＃concentration Jejunum High concentration Middle concentration Protocatechuic acid 0.479±0.117 0.430±0.061 0.184±0.010*＃ 0.635±0.139 0.552±0.067*0.239±0.032*＃Quercitrin 0.356±0.015 0.339±0.112* 0.182±0.058*＃ 0.576±0.248 0.451±0.102 0.186±0.074*＃Hirsutrin 0.282±0.030 0.271±0.099* 0.231±0.163*＃ 0.388±0.080 0.316±0.172*0.210±0.038*Myricitrin 0.045±0.011 0.034±0.008 0.007±0.002*＃ 0.055±0.016 0.044±0.003 0.008±0.003*＃

Tab 2 The K a of five ingredients of Polygonum capitatum in different concentrations at ileum and colon（±s，n＝3）

Tab 2 The K a of five ingredients of Polygonum capitatum in different concentrations at ileum and colon（±s，n＝3）

*P＜0．05 vs high concentration；＃P＜0．05 vs middle concentration

Group Ileum High concentration Middle concentration Low Low concentration Gallic acid 0.706±0.126 0.616±0.039* 0.291±0.072*＃ 0.527±0.131 0.412±0.061 0.175±0.071*＃concentration Colon High concentration Middle concentration Protocatechuic acid 0.580±0.072 0.576±0.054 0.250±0.035*＃ 0.412±0.057 0.301±0.073 0.135±0.046*＃Quercitrin 0.542±0.051 0.377±0.074* 0.200±0.116*＃ 0.259±0.022 0.172±0.043*0.106±0.050*＃Hirsutrin 0.445±0.016 0.346±0.047* 0.230±0.147*＃ 0.217±0.036 0.179±0.088*0.089±0.028*＃Myricitrin 0.056±0.008 0.048±0.025 0.008±0.005*＃ 0.032±0.007 0.018±0.004*0.004±0.002*＃

2.5 统计学处理同参考文献［6］。

3 结果

3．1 不同肠段中5个成分的单位肠管面积累计吸收量（Q）比较比较5个成分在不同肠段的单位肠管面积累积吸收量（Q），在120 min时，空肠对没食子酸、原儿茶酸及槲皮苷的累积吸收量最高，其次为回肠、十二指肠与结肠。5个成分中没食子酸、原儿茶酸与槲皮苷的累积吸收量较大，杨梅苷累计吸收量最小，5个成分在各肠道的吸收趋势为空肠、回肠＞十二指肠＞结肠。

3．2 不同浓度头花蓼提取物中5个成分在不同肠段中的K a比较对头花蓼提取物不同浓度时没食子酸等5个成分的吸收速率常数（Ka）进行方差分析比较，结果显示，在各肠段中没食子酸等5个成分的Ka随着头花蓼提取物浓度增加而增加（P＜0.05），表明没食子酸、原儿茶酸、杨梅苷、陆地棉苷及槲皮苷的吸收可能为被动吸收，见Tab 1、2。

4 讨论

本实验结果显示，没食子酸、原儿茶酸、槲皮苷、陆地棉苷及杨梅苷在小肠均有吸收，5个成分在各肠道的吸收趋势为空肠、回肠＞十二指肠＞结肠，5个成分在相同肠段中的吸收差异较大，且同一个成分在不同部位和在相同部位不同浓度的吸收也存在差异，说明小肠对中药成分具有选择性吸收，而并不是简单的半透膜被动吸收过程。且对5个成分的Ka及Q进行比较，发现这5个成分均具有浓度依赖，即5个化合物的Ka均随着头花蓼提取物药液浓度的增加而增加（P＜0.05），符合被动吸收。但是通过统计发现5个成分的浓度依赖却有强有弱，因此，推测其中有的成分除了被动扩散还有其他的转运方式，有待下一步实验对其进行考察。

参考文献：

［1］贵州省药品监督管理局DB52/YC001～420-2003.贵州省中药材、民族药材质量标准［S］.贵州省中药材、民族药材质量标准编审委员会汇编.贵州：贵州科技出版社，2003：147.

［1］Food and drug administration of Guizhou province DB52/YC001～420-2003.The quality standard of medicinal herbs，traditional medicines of Guizhou province［S］.The editorial committee of the quality standard of medicinal herbs、traditional medicines of Guizhou province.Guizhou：Guizhou Science and Technology Press，2003：147.

［2］Wilson TH，Wiseman G.The use of sacs of everted small intestine for the study of the transference of substances from the mucosal to the serosal surface［J］.JPhysiol，1954，123（1）：116.

［3］董 宇，杨 庆，朱晓新，等.黄连提取物在大鼠肠外翻实验中的吸收研究［J］.中国中药杂志，2008，33（9）：1056－60.

［3］Dong Y，Yang Q，Zhu X X，etal.Absorption of extractive Rhizoma Coptidis in rat everted gut scas［J］.China J Chin Mat Med，2008，33（9）：1056－60.

［4］Wilson TH，Wiseman G.The use of sacs of evened small intestine for the study of the transference of substances from the mucosal to the serosal surface［J］.Physiology，1954，123（1）：116.

［5］陈宝婷，徐福平，林爱华，等.翻转肠囊法研究芒果苷在大鼠的肠吸收动力学［J］.中国药理学通报，2012，28（5）：691－4.

［5］Chen B T，Xu F P，Lin A H，et al.Study on intestinal absorption ofmangiferin by everted gut sacsmodel［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（5）：691－4.

［6］陈振华，管咏梅，张 妮，等.白头翁总皂苷在大鼠肠外翻试验中吸收特性考察［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（18）：30－3.

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