三白草提取物对自由基的清除作用研究

2014-05-14刘晓欣曹光群刘学

应用化工 2014年5期

刘晓欣，曹光群，刘学

(江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡 214122)

自从Dan Harman提出衰老的自由基学说和Me.Cord首先发现SOD并成功提取以来，研究人员开始关注自由基清除剂类皮肤抗衰老化妆品的研制和应用。这类化妆品能够预防、减轻或延缓自由基对皮肤造成的老化作用，同时也深受广大消费者的喜欢。按照目前国际通用分类方法，将自由基清除剂分为两大类，即小分子和大分子自由基清除剂。除此之外，还有从植物中提取分离得到的具有自由基清除作用的活性物质，如某些黄酮类、三萜类、葱醌类及茶多酚类的化合物。因此，从植物中寻找安全有效的天然抗氧化剂也是目前重要的研究课题之一。

三白草为三白草科多年生草本植物，别名塘边藕、白花莲等。三白草生于沟旁、沼泽等低湿处，主产江苏、浙江等地，我国长江流域以南各省均有分布。三白草资源丰富，四季均可采。以全草入药，具有利尿消肿，清热解毒之功效，也可用于小便不利、淋沥涩痛、白带异常、外治疮疡肿毒和湿疹等［1-2］。三白草主要化学成分为挥发油、木脂素类、黄酮类、生物碱类化合物［3］，具有明显的降糖、抑瘤、抗炎、保肝以及抗氧化等作用［4-6］。

本实验采用三种方法，考察了三白草乙醇提取物经不同溶剂萃取所得的各部分对DPPH自由基、羟基自由基和超氧自由基的清除能力，以BHT为参考。实验结果显示，三白草乙醇提取物经不同溶剂萃取所得的各部分对DPPH自由基、羟基自由基和超氧自由基都具有清除能力，且随着提取物浓度增加，清除能力逐渐增高;其中所得的乙酸乙酯萃取部分对这3种自由基的清除作用最强。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

三白草，购自无锡中药店;乙醇、石油醚(60～90℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、焦性没食子酸(邻苯三酚)、六水合硫酸亚铁铵、浓盐酸、邻二氮菲、过氧化氢均为分析纯;DPPH、三羟甲基氨基甲烷(Tris)均为生物试剂;BHT，化学纯。

DFY-300型300 g摇摆式高速万能粉碎机;SHB-III型循环水式多用真空泵;W201型恒温水浴锅;“弘祥隆”CTXNW-2B型超声循环提取机;TU-1901双光束紫外可见分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 三白草有效成分的提取称取三白草粉末100 g，按料液比加入70%乙醇溶液1.8 L，于50℃超声提取50 min，抽滤，减压回收溶剂，真空干燥，得三白草乙醇提取物粉末。

1.2.2 三白草溶剂萃取物的制备将三白草乙醇提取物粉末溶于去离子水，得到水悬液，摇匀，倒入500 mL分液漏斗中。依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇进行多次萃取。各萃取部分的溶液再经减压蒸馏，回收各萃取剂，从而分别得到各萃取部分的浓缩物。各浓缩物用70%乙醇配制成不同浓度的溶液，备用。

1.3 清除自由基能力测定

1.3.1 清除DPPH自由基的能力测定［7］用无水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。将2 mL无水乙醇溶液及2 mL DPPH溶液加入到同一试管中，摇匀，室温下暗处静置30 min，测定其吸光度A0，同样的方法，测定2 mL DPPH溶液与2 mL待测样品溶液(或BHT溶液)混合后的吸光度A1，以及2 mL测试样品溶液与2 mL无水乙醇混合后的吸光度 A2。

1.3.2 清除羟基自由基的能力测定［8］实验中取8支试管，编号1～8。先向1～8号试管中，依次加入0.3 mL 邻二氮菲溶液(浓度 7.5 mmol/L)、1 mL Tris-HCl缓冲剂(pH=7.47)和0.3 mL 硫酸亚铁铵溶液(浓度7.5 mmol/L)，充分摇匀。再向1～6号试管中加入0.3 mL不同浓度的待测样品溶液(或BHT溶液)。向7号试管中加入0.2 mL H2O2溶液(体积分数1.8%)，8号试管中既不加样品，也不加H2O2溶液，最后用去离子水定容。在37℃恒温水浴中保温反应1 h，光谱扫描后，在最大吸收波长510 nm处测量吸光度。

式中 B1——加入待测样品的羟基自由基体系的吸光值;

B2——不加H2O2体系的吸光值;

B3——加入H2O2体系的吸光值。

1.3.3 清除超氧自由基的能力测定［9］取7支试管，先依次加入5 mL Tris-HCl(pH=8.2)缓冲溶液。在1～6号试管中，再依次加入0.3 mL不同浓度的待测样品溶液(或BHT溶液)。7号试管中加入0.3 mL去离子水，作为空白对照，即邻苯三酚自氧化率。在37℃恒温条件下，水浴20 min，再加入0.3 mL 7.5 mmol/L邻苯三酚溶液。快速摇匀，5 min内，每30 s，在320 nm处测吸光度。最后，计算吸光度随时间的变化率。

式中，C1和C2分别表示空白溶液和样品溶液的吸光度随时间的变化率。

2 结果与讨论

2.1 三白草乙醇提取物及溶剂萃取物的得率

三白草乙醇提取物及溶剂萃取物的得率见表1。

表1 三白草乙醇提物及溶剂萃取物的得率Table 1 Extraction rate of ethanol extract and various fractions of Saururus by extracting

2.2 清除DPPH自由基的能力

分别测定了三白草乙醇提取物经石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取后，各部分不同浓度的溶液对DPPH自由基的清除作用，结果见图1。

图1 三白草提取物各萃取部分对DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging effect of the fractions of the extracts of Saururus on DPPH free radical

由图1可知，三白草乙醇提物各萃取部分对DPPH自由基都具有一定的清除作用，并且随着各萃取物浓度的增加，清除能力也逐渐增强。各萃取部分对DPPH自由基的清除能力为:乙酸乙酯层＞正丁醇层＞氯仿层＞石油醚层。其中乙酸乙酯萃取部分对DPPH自由基的清除能力相对最强，当浓度在50 mg/L时，对DPPH自由基的清除率为90.02%。

2.3 清除羟基自由基的能力

分别测定了三白草乙醇提取物经石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取后，各部分不同浓度的溶液对·OH自由基的清除作用，结果见图2。

图2 三白草提取物各萃取部分对羟基自由基的清除能力Fig.2 Scavenging effect of the fractions of the extracts of Saururus on·OH free radical

由图2可知，三白草乙醇提物各萃取部分对·OH自由基都具有一定的清除作用，并且随着各萃取物浓度的增加，清除能力也逐渐增强。各部分对·OH自由基的清除能力为:乙酸乙酯层＞正丁醇层＞石油醚层＞氯仿层。其中乙酸乙酯萃取部分对·OH自由基的清除能力相对最强，当浓度在50 mg/L时，对羟基自由基的清除率为45.12%。

2.4 清除超氧自由基的能力

分别测定了三白草乙醇提取物经石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取后，各部分不同浓度的溶液对超氧自由基的清除作用，结果见图3。

图3 三白草提取物各萃取部分对超氧自由基的清除能力Fig.3 Scavenging effect of the fractions of the extracts of Saururus on O2－·free radical

由图3可知，三白草乙醇提物各萃取部分对超氧自由基都具有一定的清除作用，并且随着各萃取物浓度的增加，清除能力也逐渐增强。各部分对超氧自由基的清除能力为:乙酸乙酯层＞正丁醇层＞氯仿层＞石油醚层。其中乙酸乙酯萃取部分对超氧自由基的清除能力相对最强，当浓度在1.0 mg/L时，对超氧自由基的清除率为74.11%。