固定化脂肪酶合成蔗糖月桂酸酯的研究

李云凯，张志众，程 磊

（唐山学院 环境与化学工程系，河北 唐山063000）

蔗糖脂肪酸酯简称蔗糖酯，指蔗糖与正羧酸反应生成的一大类有机化合物的总称，由亲水的蔗糖和亲油的脂肪酸组成［1］。蔗糖月桂酸酯是蔗糖酯的一种，是极好的表面活性剂和乳化剂。它无嗅、无味、无毒和无刺激性，可100%生物降解，对环境友好，因此应用范围极其广泛［2］。传统的蔗糖月桂酸酯产品多是采用化学法合成的，合成反应在高温、高压下进行，条件苛刻，终产物带有颜色，同时发生多个平行反应，导致催化反应选择性差，有副产物生成。而采用酶法合成蔗糖月桂酸酯，反应条件温和，且区位选择性和立体选择性强，表面活性性质突出，具有很好的应用前景。

1 材料和方法

1．1 材料

蔗糖月桂酸单酯（美国Sigma公司生产），蔗糖月桂酸酯标样（上海龙尼精细化工有限公司），蔗糖、月桂酸、DMSO（二甲基亚砜）、叔丁醇均为分析纯，固定化脂肪酶采用包埋法自制。

1．2 方法

1．2．1 蔗糖月桂酸酯的酶促合成

在150 m L的锥形瓶中加入一定比例的蔗糖和月桂酸，加入5 mL DMSO／叔丁醇有机溶剂，再加入一定量的磷酸盐缓冲液。预热至50℃左右完全溶解，冷却至室温，加入固定化脂肪酶在摇床上振荡10 min混匀。然后放置振荡培养箱中继续反应6 h，结束反应，检测鉴定并计算产率。

1．2．2 转化率的测定

结束反应，离心除去脂肪酶，用酚酞作为指示剂加入0．1 mol／L的NaOH中和反应体系中残留的月桂酸，以月桂酸的减少量计算酯化率，结果以相对转化率表示［3－4］：相对转化率＝反应前后月桂酸物质的量的差值÷初始反应体系月桂酸的物质的量×100%。

2 结果与分析

2．1 月桂酸和蔗糖的摩尔比对酯化反应的影响

保持固定化脂肪酶的量一定，调节初始月桂酸与蔗糖的摩尔比为2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1进行酯化反应，反应结束后计算相对转化率，结果见图1。

图1 月桂酸与蔗糖摩尔比对酯化反应的影响

由图1可知，当月桂酸与蔗糖的摩尔比小于2时，基本上没有酯化反应发生；大于2时，随摩尔比的增大，转化率增加；摩尔比为8时能达到较高的转化率，在90%左右，摩尔比大于8时转化率变化平缓。因为酶催化的大部分反应是正逆反应速率都比较显著的可逆反应，要使关键组分进行转化，必须保持另一种物质的过量存在反应才能以较快的速度向正反应方向进行，当达到一定限度后，再增加过量组分的量，反应速率增加不再明显，而且由于酶受空间位阻的影响反而有可能会使反应速率下降［5］。

2．2 固定化脂肪酶用量对酯化反应的影响

称取固定化脂肪酶的用量为0．1 g，0．2 g，0．3 g，0．4 g，0．5 g，其他条件固定，置于恒温振荡培养箱中进行酯化反应，反应完成后测定酯化率，计算相对转化率。

酶的浓度即用量的提高可以显著缩短达到相同转化率时所用的反应时间，但增加了生产成本，因此需要对转化率和酶的用量进行优化。在其他条件不变的情况下，仅改变脂肪酶用量得到的相对转化率如图2所示。

图2 脂肪酶用量对酯化反应的影响

由图2可知，随着酶用量的增加，蔗糖月桂酸酯的相对转化率在一定范围内呈线性方式增加，当酶用量达到0．3 g时相对转化率达到91%，而后再提高酶浓度，发现转化率几乎维持不变，说明催化活性中心周围不仅没有足够的底物进行反应反而造成了活性中心的“浪费”［6］。因而，当酶用量超过一定数值，相对转化率反而有下降的趋势，其原因可能是过量的酶吸附了反应过程中的溶剂，导致部分底物过饱和而析出，也可能是过量的酶加速了逆反应的进程即产物的分解，对转化率产生了一定的影响。

2．3 温度对酯化反应的影响

保持月桂酸、蔗糖及酶用量的比例不变，反应温度分别设定为25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，反应结束后测定酯化率，计算相对转化率，结果见图3。

图3 温度对酯化反应的影响

由于酶的催化反应都存在最适的反应温度，在此温度范围酶的催化反应速率达到最大，低于或高于此温度反应速率都会下降，酯化反应的进程显然会受影响。由图3可以看出，在30℃时相对转化率最大，而后随着温度的升高，转化率明显降低，说明此时酶的催化能力下降，该固定化脂肪酶的最适反应温度为30℃。

2．4 缓冲液p H值对酯化反应的影响

严格配制p H 值分别为6．5，7．0，7．5，8．0，8．5的缓冲液，其他条件不变，在恒温振荡培养箱中进行酯化反应，反应结束后计算相对转化率。结果见图4。

图4 缓冲液p H值对酯化反应的影响

维持正常的催化反应活性，酶要求其反应体系的p H值的大小有一定的范围，同时，缓冲体系含有的定量的水对蔗糖分子存在形态有一定的影响。由图4可知，当缓冲液的p H值增大时，相对转化率呈现先增大后减小的趋势，当p H为7．5时，相对转化率最大，再增大缓冲液p H值，转化率则会下降。说明固定化脂肪酶的催化活性有最适的p H值，体系p H值偏碱性使转化率降低也可能是反应产物的水解加剧所致。

2．5 反应时间对酯化反应的影响

调节两种反应物初始摩尔比8∶1，脂肪酶用量0．3 g，反应温度设定在30℃，反应体系的p H调节为7．5。改变反应时间分别为2 h，4 h，6 h，8 h，10 h进行酯化反应，反应结束后计算相对转化率。结果见图5。

图5 反应时间对酯化反应的影响

酶催化反应的反应时间要显著小于使用化学催化剂时的反应时间，但时间太短也会使反应不够完全，转化率低，时间过长逆反应速率会增大使反应产物水解。由图5可知，当反应时间小于6 h时，产物的转化率一直在显著的增大，说明反应过程是一个缓慢的进程，反应需要充足的时间，但反应超过6 h转化率又有明显的下降趋势，说明生成的蔗糖月桂酸酯的水解速率加剧，产物减少。

2．6 固定化脂肪酶的重复活性测定

本实验采用的脂肪酶是用包埋法自制的固定化脂肪酶，检验脂肪酶活性以便判断其是否可以多次重复利用，以减小成本或者推广到其他类似实验中。固定其他条件均为最优条件，以脂肪酶催化的初始反应速率为指标对脂肪酶重复使用4次的数据进行分析。如图6所示，随着重复次数的增多，酶催化反应的初速率呈显著下降趋势，在使用3次后，酶的反应初速率从最初的0．234 mol／（L·min）下降到了0．13 mol／（L·min），下降近一倍，已不适合继续进行催化反应，同时有解体的趋势，故本实验所用的催化剂的重复使用次数控制在2次以内为宜，超过2次则需更换新的催化剂。的吸收峰为羰基的伸缩振动吸收，1 113 cm－1是C－O－C的伸缩振动吸收，是酯的特征吸收峰。此外还有明显的2 928 cm－1羟基的伸缩振动吸收和951 cm－1附近的糖苷键特征吸收，而且反应得到的产物和蔗糖月桂酸单酯标准品的红外光谱图的特征图谱形状基本相同，说明本实验合成的产品是蔗糖月桂酸酯，得到的应该是单酯和多酯的混合物。

图6 固定化酶的循环使用

图7 蔗糖月桂酸酯的薄层色谱图

图8 反应物和产物的红外光谱图

2．7 产物的薄层色谱分析

图7为蔗糖月桂酸酯的薄层色谱图。图右端有一系列的斑点，最下端为蔗糖月桂酸单酯，其与标准品的位置相对应，其他位置的斑点较浅，应该是产物中其他的脂肪酸酯混合物。

2．8 产物的红外光谱分析

月桂酸、蔗糖月桂酸单酯标准品及产物的红外光谱图如图8所示。由图8可知，3 322 cm－1附近的峰为－OH的伸缩振动吸收，2 916 cm－1为CH 的伸缩振动吸收，1 450 cm－1处为DC－H伸缩振动吸收。提纯的反应产物在1 738 cm－1处

3 结论

在有机相溶剂DMSO／叔丁醇体系中，以固定化脂肪酶为催化剂催化月桂酸与蔗糖的酯化反应，结果表明，当月桂酸与蔗糖的摩尔比大于8，反应温度为30℃，固定化脂肪酶用量为0．3 g，缓冲液体系p H值为7．5，反应6 h时，酯化反应的相对转化率较高，可达到90%以上。对自制的固定化脂肪酶重复活性测定结果表明，本催化剂重复使用次数控制在2次为宜。通过对有机溶剂提取的反应产物进行薄层色谱及红外光谱分析，证实所合成的产物为蔗糖月桂酸酯。

［1］ 赵裕蓉，王宁玲．生物法制蔗糖酯──生物表面活性剂［J］．北京化工大学学报：自然科学报，1996，23（4）：6－10．

［2］ 李祖义，徐国梁，袁长贵，等．生物表面活性剂催化合成蔗糖酯及其应用［J］．上海化工，1999，24（21）：6－8．

［3］ 张军，徐家立．固定化假丝酵母1619脂肪酶催化油酸油醇酯 的 合 成 ［J］．生 物 工 程 学 报，1995，11（4）：325－331．

［4］ 寇秀芬，徐家立．酶法合成糖及糖醇酯［J］．微生物学报，2000，40（2）：193－197．

［5］ Sarney D B，Kapeler H，Fregapane G，et al．Chemoenzymatic synthesis of disaccharide fatty acid esters［J］．J Am Oil Chem，1994，71（7）：711－714．

［6］ 谭贤勇．非水相酶法合成蔗糖－6－酯的研究［D］．南宁：广西大学，2006．