不同样品溶剂对高效液相色谱-蒸发光散射检测器测定黄芪甲苷的影响*

徐静,刘天强,彭衡阳,肖丹,2

(1.通威股份有限公司,成都 610041;2.成都中医药大学,成都 611137)

·药物制剂与药品质量控制·

不同样品溶剂对高效液相色谱-蒸发光散射检测器测定黄芪甲苷的影响*

徐静1,刘天强1,彭衡阳1,肖丹1,2

(1.通威股份有限公司,成都 610041;2.成都中医药大学,成都 611137)

目的 考察不同样品溶剂对高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定黄芪甲苷的影响。方法以黄芪和感毒清颗粒为样品,以甲醇、90%甲醇、80%甲醇、70%甲醇、32%乙腈、15%乙腈和水为样品溶剂,采用HPLC-ELSD测定黄芪甲苷的含量。结果以90%甲醇溶液为样品溶剂,其系统适用性良好,准确度、精密度、线性关系等方法学验证指标符合要求。结论采用90%甲醇溶液作为样品溶剂,更有利于黄芪及制剂中黄芪甲苷的质量控制。

黄芪甲苷;样品溶剂;溶剂效应;色谱,高效液相;检测器,蒸发光散射

在反相高效液相色谱中,当溶解样品的溶剂(以下简称“样品溶剂”)较流动相的洗脱强度强时,可能产生峰变形、峰面积变化、柱效降低等溶剂效应[1-2];解决方法有以流动相或相近的溶剂溶解样品、减小进样体积、以强溶剂(即溶剂洗脱能力比流动性强)溶解样品后用等体积流动相稀释后进样或以弱溶剂溶解样品后加大进样量等能够降低样品溶剂强度来消除;已报道的品种有阿魏酸、黄芩苷、青藤碱、格列奈的左旋异构体、盐酸小檗碱片和盐酸环丙沙星片等[3-5]。笔者在开展抗沙门氏菌的中草药体外筛选试验研究中,为保证药材质量,对待筛药材黄芪的有效成分——黄芪甲苷进行含量测定时,参照《中华人民共和国药典》2010年版方法,均以甲醇为样品溶解的溶剂[6-7],多次出现同一份样品连续进样的峰面积差异大、拖尾严重,偶有裂峰、双头峰等现象。在排查环境条件(实验室温湿度),高效液相系统(流动相配比、流速、色谱柱、柱温)和检测器(雾化温度、气流速度)等因素后,认为溶剂效应是致此现象的重要因素。笔者结合系统适用性实验,以峰面积变化为主要考察指标,考察并筛选了能降低溶剂强度的样品溶剂,最后进行方法学验证,旨在为黄芪及其制剂提供更优的色谱条件。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-2010AHT高效液相色谱仪(日本岛津公司),2000ES检测器(美国Alltech公司),BP211D电子天平[d=0.01 mg(80 g),d=0.1 mg(210 mg),德国赛多利斯公司],KQ5200E型超声波清洗器(工作频率:40 kHz,昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 黄芪甲苷(中国食品药品检定研究院,批号:110727-200613),黄芪(成都国际商贸城荷花池中药材专业市场,产地为内蒙古,符合《中华人民共和国药典》2010版一部黄芪项下有关规定),感毒清颗粒(四川禾正制药有限责任公司,中试样品,批号: 120314,120315,120316),乙腈为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 精密称取过筛孔内径(250 ±9.9)μm筛的黄芪药材粉末4 g,置索氏提取器中,加甲醇40 mL,冷浸过夜,加热回流4 h,提取液蒸干,残渣加水10 mL,微热使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取4次,每次40 mL,合并正丁醇液,用氨试液充分洗涤2次,每次40 mL,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣加水5 mL使溶解,放冷。通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5 cm,柱高为12 cm),以水50 mL洗脱,弃去水液,再用40%乙醇30 mL洗脱,弃去洗脱液,继用70%乙醇80 mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加待考察的样品溶剂定容至5 mL,过孔径0.45μm微孔滤膜,即得供试品A溶液。取感毒清颗粒(批号: 120314)和缺黄芪阴性颗粒,研细,分别精密称取4和3 g,置索氏提取器中,同法制成供试品B溶液和阴性样品溶液[7]。

2.2 色谱条件 色谱柱:Welch UltimateTMC18(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:乙腈-水(32∶68);流速:1 mL·min-1;柱温:25℃;蒸发光检测器的检测参数:漂移管温度100℃,气体流速2.8 L·min-1,撞击器状态为关,信号放大倍数为1。

2.3 考察不同样品溶剂对测定黄芪甲苷的影响 将“2.1”项下“待考察的样品溶剂”分别拟定为“甲醇、90%甲醇、80%甲醇、70%甲醇、32%乙腈、15%乙腈和水”制成供试品溶液,并分别配制黄芪甲苷对照品溶液(约0.5 mg·mL-1)。其中样品在甲醇、90%甲醇中完全溶解,在80%甲醇、70%甲醇、水中出现轻微糊化现象,在32%乙腈、15%乙腈中出现明显糊化现象。照“2.2”项下的色谱条件,取对照品、供试品A、B和阴性溶液依次进样10μL,各连续进样5次(对照品进样5次是系统适用性实验的要求,样品进样5次是为了考察峰面积的变化情况),记录色谱图和峰面积。在各种拟定的样品溶剂下,黄芪甲苷对应峰的位置,供试品与对照品保留时间基本一致、阴性无干扰,分离度、理论板数等指标良好,对应的峰面积见表1。

表1 不同样品溶剂对黄芪甲苷峰面积的影响Tab.1 Effect of different solvents on peak area of AstragaliⅣ

由表1可知,以甲醇为样品溶剂,对样品溶解性能良好,但其溶剂强度强于流动相,溶剂效应比较明显,表现为峰面积不稳定;随着甲醇浓度的降低,溶剂效应开始减弱,但对样品的溶解性能也逐渐减弱,峰面积较甲醇为样品溶剂的峰面积明显偏小,可能是样品溶解不充分,黄芪甲苷有部分包裹所致。另外,以不同比例的乙腈-水(流动相或比流动相中有机相溶度更低的溶剂)作为样品溶剂也可减弱溶剂效应,但对样品的溶解性能极差,峰面积也偏小。综合溶解性能和降低溶剂效应等方面考虑,以90%甲醇作为样品溶剂更有优势。

2.4 方法学验证 以感毒清颗粒和缺黄芪阴性颗粒剂样品,照“2.1”项下“待考察的样品溶剂”确定为“90%甲醇”,分别制备供试品和阴性样品溶液,并以90%甲醇配制黄芪甲苷对照品溶液(0.508 mg·mL-1),进行方法学考察。

2.4.1 专属性实验 照“2.2”项下的色谱条件,取对照品、供试品和阴性样品溶液各10μL进样,记录色谱图,结果显示阴性无干扰。见图1。

A.阴性样品;B.黄芪甲苷对照品;C.供试品;1.黄芪甲苷图1 感毒清颗粒专属性色谱图A.negative sample;B.standard substance of astragaliⅣ;C. sample;1.astragaliⅣFig.1 Specificity chromatography for ganduqing granuless

2.4.2 线性关系考察 分别精密吸取黄芪甲苷对照品溶液5,10,15,20,25μL注入液相色谱仪,以黄芪甲苷浓度进样量为横坐标(X),峰面积值的自然对数为纵坐标(Y),进行回归分析,Y=1.672 8X+12.164,R2= 0.999 6。表明黄芪甲苷2.54～12.70μg呈良好的线性关系。

2.4.3 精密度实验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液10μL,连续测定6次,结果峰面积RSD=1.14%。

2.4.4 样品溶液的稳定性实验 取同一供试品溶液(批号:20120314)10μL,分别于0,2,4,8,16 h测定,以外标两点法计算,结果黄芪甲苷含量值RSD= 1.23%,表明供试品溶液在16 h内基本稳定。

2.4.5 重复性实验 称取样品6份(批号: 20120314),照“2.1”项下“待考察的样品溶剂”确定为“90%甲醇”制成供试品溶液,精密吸取黄芪甲苷对照品溶液10和20μL、供试品溶液10μL,测定,以外标两点法计算,黄芪甲苷含量平均值为0.914 9 mg·g-1, RSD=1.41%,表明本法重复性良好。

2.4.6 准确度实验 采用加样回收实验:取已知准确含量的样品(批号:20120314)6份,每份约2 g,精密称定,分别加入黄芪甲苷对照品(2.02 mg·mL-1)1 mL,照“2.1”项下“待考察的样品溶剂”确定为“90%甲醇”制成供试品溶液,精密吸取黄芪甲苷对照品溶液10和20μL、供试品溶液10μL,测定,以外标两点法计算黄芪甲苷含量,结果显示平均回收率为100.04%,RSD= 2.83%。见表2。

表2 加样回收率实验结果Tab.2 Results of recovery test

2.4.7 样品含量测定 分别取3批(批号:120314, 120315,120316)感毒清颗粒,照“2.1”项下“待考察的样品溶剂”确定为“90%甲醇”制成供试品溶液,精密吸取黄芪甲苷对照品溶液10和20μL、供试品溶液10μL,测定,以外标两点法计算黄芪甲苷含量。结果黄芪甲苷含量依次为0.92,0.94,0.91 mg·g-1,平均含量0.92 mg·g-1。

3 讨论

本实验是在采用《中华人民共和国药典》2010年版一部测定黄芪及其制剂中黄芪甲苷含量过程中产生溶剂效应时所进行的探索性研究。笔者除尝试了较原样品溶剂(甲醇)强度更低的不同浓度的甲醇溶液和乙腈溶液外,曾尝试先以甲醇、N,N-二甲甲酰胺或二甲亚砜将样品溶解后再以流动相稀释后进样,样品糊化现象依然严重;另外,通过降低样品进样量(如5μL),若使其峰面积在黄芪甲苷对照品的两点之间(外标两点法来计算含量),势必降低对照品的浓度或进样量,在仪器灵敏度已确定的情况,此法将大大受限,故未作相应的考察;最终选择了对样品溶解性能良好、可有效地消除溶剂效应对含量测定影响的90%甲醇作为样品溶剂,经方法学验证是合理、可行的,将更有利黄芪及其制剂的中黄芪甲苷的质量控制。

[1] WILLIAMSK J,LIWAN PO A,IRWINW J.Sample-solvent induced peak broadening in the reversed phase high performance liquid chromatography of aspirin and related analgesics[J].JChromatogr Sci,1980,194(2):217-223.

[2] TSIMIDOU M,MACRAE R.Influence of the injection solvent on the reversed-phase chromatography of triglycerides[J].J Chromatogr Sci,1984,285(1):178-181.

[3] COOKE N H C,ARCHER B G,OLSEN K,et al.Comparison of three-and five-micrometer column packings for reversedphase liquid chromatography[J].Anal Chem,1982, 54(13):2277-2283.

[4] WREZEL PW,CHION I,PAKULA R.Key factors in sample diluent selection for HPLC assays of active phamaceutical ingredients[J].LC GC North America,2005,23(7):682-686.

[5] 王丽,申兰慧,陈国清.浅谈样品溶剂对高效液相色谱行为的影响[J].中国药事,2013,27(2):163-166.

[6] 梅雪.感毒清颗粒的药学研究[D].成都:成都中医药大学,2012.

[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:283.

DOI 10.3870/yydb.2014.12.022

Effect of Different Sam p le Solvents on Determ ination of AstragalosideⅣby High Performance Liquid Chromatograph-Evaporative Light Scattering Detector

XU Jing1,LIU Tian-qiang1,PENG Heng-yang1,XIAO Dan1,2
(1.Tongwei Co.,Ltd,Chengdu 610041,China;2. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China)

Objective To explore the effect of sample-solvent compositions on the determination of AstragaliⅣby high performance liquid chromatograph-evaporative light scattering detector(HPLC-ELSD).MethodsRadix astragali andganduqinggranules served as samples.Methanol,90%methanol,80%methanol,70%methanol,32%acetonitrile,15%acetonitrile, and water were sample solvents.HPLC-ELSD was used to determine content of astragalosideⅣ.ResultsThe results showed that the 90%methanol solution was an appropriate sample solventwith good system suitability,precision,accuracy,and,linearityetc..ConclusionThismethod benefits the quality control of astragalosideⅣin Radix astragali and agents containing Radix astragali.

AstragaliⅣ;Sample-solvent;Solvent effect;Chromatograph,high performance liquid;Detector,evaporative light scattering

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)12-1624-04

2013-09-23

2014-03-14

*国家国际科技合作专项资助(2010DFA32380)

徐静(1987-),男,四川南充人,工程师,硕士,主要从事药物制剂与分析研究。电话:028-86168993,E-mail: 410744515@qq.com。

肖丹(1962-),女,四川成都人,教授,博士,主要从事药剂学研究。电话:028-86168993,E-mail:xuj01@ tongwei.com。