金钗石斛水煎剂对糖尿病肾病大鼠肾脏PPARγ表达的影响*

刘园园,张艳磊,何晓然,李小琼,唐彦萍

(遵义医学院生物化学教研室,遵义 563003)

金钗石斛水煎剂对糖尿病肾病大鼠肾脏PPARγ表达的影响*

刘园园,张艳磊,何晓然,李小琼,唐彦萍

(遵义医学院生物化学教研室,遵义 563003)

目的 通过观察金钗石斛水煎剂对糖尿病肾病(DN)大鼠肾皮质过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)表达的影响,探讨其对DN的保护作用及相关机制。方法将60只健康SD大鼠随机分为6组,每组10只:正常对照组(NC组),模型对照组(DN组),罗格列酮组(RGZ组),金钗石斛小剂量(LD)、中剂量(MD)、大剂量(HD)干预组。在大鼠糖尿病造模成功后各组分别给药12周,观察大鼠肾脏病理、Real-time PCR法检测大鼠肾皮质PPARγmRNA表达、Western blot法检测大鼠肾皮质中PPARγ蛋白表达的情况。结果金钗石斛水煎剂能明显改善糖尿病大鼠肾脏基底膜增厚及足突增粗融合;增加DN大鼠肾皮质中PPARγmRNA及蛋白的表达(P＜0.05或P＜0.01)。结论金钗石斛水煎剂可以减轻DN大鼠的肾损伤,其机制可能与上调DN大鼠肾皮质中PPARγ表达有关。

金钗石斛水煎剂;肾病,糖尿病;过氧化物酶体增殖物激活受体γ

金钗石斛是一种名贵中药材,具有降血糖、抗氧化、抗肿瘤、调节免疫等药理作用。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARγ)是核受体转录因子超家族成员之一,其主要分布在肾脏髓质集合管,肾脏其他部位也有少量分布[1]。近期研究发现,上调PPARγ表达可以减轻糖尿病肾脏损伤[2]。PPARγ激动药罗格列酮是胰岛素增敏剂,研究发现它能改善胰岛素抵抗、降低血糖[1]。笔者采用链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导大鼠糖尿病肾病模型,用不同浓度金钗石斛水煎剂干预,观察金钗石斛水煎剂对糖尿病肾病大鼠肾皮质PPARγ基因表达影响。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley, SD)大鼠,体质量180～200 g,第三军医大动物实验中心提供,合格证号:SCXK(渝)2007-0005。大鼠分笼饲养于日照12 h,室温18～25℃,相对湿度45%～55%,通风良好的环境中,进食普通颗粒饲料,自由饮水。

1.2 药品与试剂 金钗石斛(遵义赤水金钗石斛基地提供,经贵阳中医学院王世清教授和本院药学系杨建文教授鉴定),马来酸罗格列酮(天津葛兰素史克公司,批准文号:国药准字H20020475,批号:10125188),STZ(美国Sigma公司,批号:S0130),大鼠胱抑素C(cystatin C, CysC)酶联免疫试剂盒,大鼠β2-微球蛋白(β2-MG)酶联免疫试剂盒(美国R&D公司),兔抗大鼠PPARγ多克隆抗体(英国Abcam公司),辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(北京博奥生物技术有限公司)。

1.3 仪器 Bio-Rad CFX荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD科技有限公司),Western blot电泳系统(美国BIO-RAD科技有限公司),全自动生化分析仪AU5400(日本贝克曼库尔特公司)。

1.4 金钗石斛水煎剂的制备 金钗石斛粗粉,分别加入10倍量双蒸水,煎煮3次,合并3次滤液,用旋转蒸发仪浓缩为质量浓度相当于生药2 g·mL-1的浸膏。

1.5 动物模型建立及分组 健康雄性SD大鼠60只,随机分为正常对照组(NC组,n=10)和糖尿病模型对照组,糖尿病模型对照组给予STZ 60 mg·kg-1,单次腹腔注射。72 h后测血糖,连续3 d血糖≥16.7 mmol·L-1确定为糖尿病大鼠[3]。将成模大鼠随机分为模型对照组(DN组),罗格列酮组(RGZ组,给予罗格列酮2 mg·kg-1·d-1),金钗石斛小剂量、中剂量、大剂量组(LD、MD、HD组,分别给予相当于金钗石斛生药5,10, 20 g·kg-1·d-1)。每组10只,每日一次灌胃,连续给药12周后,检测6组大鼠血糖、摘取肾脏。

1.6 一般项目检测 血糖、体质量、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)法检测糖尿病大鼠血清CysC和尿液中β2-MG含量,尿素氮用全自动生化分析仪AU5400检测。

1.7 透射电子显微镜观察大鼠肾组织形态学变化 肾皮质切成组织块1 mm3,经3%戊二醛、1%锇酸固定,漂洗、脱水,环氧树脂包埋,切片、染色,电镜下观察肾脏超微结构。

1.8 Real-time PCR法检测各组大鼠肾皮质PPARγ mRNA表达的影响 PPARγ特异性引物Forward:5′-CCTCCCTGATGAATAAAGATGG-3′,Reverse:5′-CACAGCAAACTCAAACTTAGGC-3′,β-actin特异性引物Forward:5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′,Reverse:5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′(上海生物工程公司)。

1.9 Western blot法检测大鼠肾皮质PPARγ蛋白表达 肾皮质总蛋白经10%聚丙烯凝胶电泳后电转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上, 5%脱脂奶粉室温封闭1 h,1∶400稀释一抗,4℃孵育过夜,TBST洗膜3次,1∶1 000稀释羊抗兔IgG二抗,室温孵育1 h,增强化学发光法(enhanced chemiluminescence,ECL)发光、显影、定影。

2 结果

2.1 饮水量、饮食量、尿量 实验结束时大鼠存活47只,死亡13只。其中DN组死亡3只,死亡原因考虑为感染、酮症酸中毒、肠胀气;RGZ组死亡2只,死亡原因为并发感染;金钗石斛3个剂量组共死亡8只,大鼠大体解剖观察可见2只烂尾,颈部有囊肿,1只肠胀气,其余5只未见明显异常;NC组无死亡。

STZ诱导的糖尿病大鼠明显出现多饮、多食、多尿等症状(P＜0.01);与DN组相比,MD组和HD组饮水量和尿量减少(P＜0.05,P＜0.01);而饮食量,DN组与RGZ组和金钗石斛3个剂量组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 血糖、体质量、肾指数 实验12周末,STZ诱导糖尿病模型体质量低于NC组(P＜0.01)而血糖和肾指数均高于NC组(P＜0.01);与DN组相比,RGZ组和HD组大鼠血糖降低,体质量增加(P＜0.01),而肾指数在RGZ组和金钗石斛3个剂量组与DN组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表1 6组实验大鼠饮水量、饮食量和尿量比较Tab.1 Comparison of water intake,food intake and urine volume of in six groups of rats ±s

表1 6组实验大鼠饮水量、饮食量和尿量比较Tab.1 Comparison of water intake,food intake and urine volume of in six groups of rats ±s

与NC组比较,*1P＜0.01;与DN组比较,*2P＜0.05,*3P＜0.01Compared with group NC,*1P＜0.01;compared with group DN,*2P＜0.05,*3P＜0.01

组别大鼠/只饮水量/ [mL·(24 h)-1]饮食量/ [g·(24 h)-1]尿量/ [mL·(24 h)-1] NC组10 28.30±5.74 22.63±1.77 10.70±1.51 DN组7 200.71±48.05*1 52.66±8.26*1 87.71±10.06*1RGZ组8 108.00±33.87*1*2 42.36±5.21*1 36.38±6.65*1*3LD组8 135.50±27.84*1 49.91±11.23*1 66.75±9.35*1*2MD组7 115.86±30.84*1*2 46.53±8.04*1 40.57±6.80*1*3HD组7 91.71±15.77*1*2 42.04±6.93*1 47.29±9.83*1*3

2.3 血清CysC、尿素氮、β2-MG检测 糖尿病大鼠血清CysC、尿素氮、β2-MG都高于NC组(P＜0.01);LD、MD、HD组和RGZ组的血清中CysC和尿素氮与DN组差异有统计学意义(P＜0.01);而β2-MG,MD和HD组低于DN组,差异有统计学意义(P＜0.01),HD组与RGZ组差异无统计学意义。见表3。

2.4 电镜结果 电镜观察结果见图1。如箭头所示: NC组基底膜结构完整,基底膜厚度均匀一致,无足突增粗融合;STZ诱导的DN组基底膜厚薄不均,肾小球脏层上皮细胞足突增粗、融合、破坏;HD组和RGZ组基底膜厚度均匀一致,无明显增厚,有部分足突融合。

2.5 Real-time PCR法检测mRNA的表达 荧光定量PCR结果显示:与NC组相比,DN组大鼠肾皮质PPARγ mRNA表达量降低(P＜0.01);而RGZ组PPARγmRNA表达量高于DN组(P＜0.01);MD组和HD组可以上调PPARγ表达(P＜0.05或P＜0.01),其中HD组与RGZ组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表4。

表2 6组实验大鼠血糖、体质量、肾指数比较Tab.2 Comparison of blood glucose,body weight and kidney index in six groups of rats ±s

表2 6组实验大鼠血糖、体质量、肾指数比较Tab.2 Comparison of blood glucose,body weight and kidney index in six groups of rats ±s

与NC组比较,*1P＜0.01;与DN组比较,*2P＜0.01Compared with group NC,*1P＜0.01;compared with group DN,*2P＜0.01

组别大鼠/只血糖/(mmol·L-1)体质量/g肾指数/(×103) NC组10 5.78±0.77 403.21±48.61 1.92±0.27 DN组7 26.91±1.12*1181.83±17.73*17.85±2.31*1RGZ组8 22.63±2.22*1*2252.51±56.72*1*24.29±0.87*1LD组8 26.10±1.57*1201.33±25.09*16.17±1.04*1MD组7 25.64±1.91*1223.79±30.89*15.45±1.01*1HD组7 24.17±2.25*1*2247.14±56.43*1*24.68±1.33*1

表3 6组实验大鼠血清CysC、尿素氮、β2-MG比较Tab.3 Comparison of the serum level of CysC,urea andβ2-MG in six groups of rats ±s

表3 6组实验大鼠血清CysC、尿素氮、β2-MG比较Tab.3 Comparison of the serum level of CysC,urea andβ2-MG in six groups of rats ±s

与NC组比较,*1P＜0.01;与DN组比较,*2P＜0.01Compared with group NC,*1P＜0.01;compared with group DN,*2P＜0.01

组别大鼠/只血清CysC/ (μg·L-1)尿素氮/ (mmol·L-1) β2-MG/ (ng·L-1) NC组10 575.75±53.33 9.68±1.19 46.71±4.01 DN组7 911.89±72.45*122.73±3.47*170.25±6.13*1RGZ组8 593.85±74.43*213.28±2.40*1*254.04±2.37*1*2LD组8 676.20±68.84*1*216.34±2.53*1*265.59±3.41*1MD组7 612.44±32.41*213.86±2.71*1*260.86±5.84*1*2HD组7 587.67±65.09*213.32±2.67*1*257.53±5.97*1*2

A.NC组;B.DN组;C.RGZ组;D.HD组图1 4组实验大鼠肾脏电镜观察结果(×8 900)A.group NC;B.group DN;C.group RGZ;D.group HDFig.1 Renal pathology of four groups of rats by electron m icroscope(×8 900)

2.6 Western blot检测各组大鼠肾皮质中PPARγ蛋白表达水平 Western blot实验结果显示:NC组大鼠肾皮质PPARγ高表达,而DN组表达量降低(P＜0.01),给予金钗石斛水煎剂灌胃12周后,MD组和HD组上调糖尿病大鼠肾皮质中PPARγ蛋白表达量(P＜0.05或P＜0.01),与RGZ组比较组间差异无统计学意义。见表4,图2。

表4 6组大鼠肾皮质中PPARγm RNA及蛋白表达比较Tab.4 Comparison of PPARγm RNA and protein expression of in renal cortex in six groups of rats ±s

表4 6组大鼠肾皮质中PPARγm RNA及蛋白表达比较Tab.4 Comparison of PPARγm RNA and protein expression of in renal cortex in six groups of rats ±s

与NC组比较,*1P＜0.01,*3P＜0.05;与DN组比较,*2P＜0.01,*4P＜0.05Compared with group NC,*1P＜0.01,*3P＜0.05;compared with group DN,*2P＜0.01,*4P＜0.05

灰度值NC组组别大鼠/只PPARγmRNA (PPARγ/β-actin) PPARγ灰度值/ β-actin 10 1 1.11±0.29 DN组7 0.18±0.09*10.45±0.19*1RGZ组8 1.39±0.69*21.03±0.34*2LD组8 0.34±0.23*10.75±0.30*3MD组7 0.86±0.64*40.92±0.42*4HD组7 0.92±0.49*21.07±0.39*2

图2 6组大鼠肾皮质PPARγ蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophotogram of PPARγprotein expression in the renal cortex in six groups of rats

3 讨论

金钗石斛味甘、微咸、微寒,归胃、肾经,具有滋阴清热、润肺止咳、生津益胃的功效,其有效成分为多糖和生物碱,具有降血糖、抗氧化、抗肿瘤、调节免疫等药理作用[4]。参与石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛浸膏溶液、石斛清胃散等产品组成,对咽喉疾病、肠胃疾病、白内障、心血管疾病、糖尿病有显著疗效[4]。笔者拟从其对糖尿病的作用研究其作用的分子机制。

本研究发现,STZ诱导的糖尿病组大鼠12周后出现典型的糖尿病症状,并且电镜结果可见肾脏结构出现系膜细胞肿胀,系膜基质增生,基底膜增厚,足突融合等病理改变,表明有糖尿病肾损伤。金钗石斛大剂量组肾脏损伤较轻,仅见部分足突融合。肾功能检测显示DN组大鼠血清中CysC、尿素氮和尿中β2-MG含量增加,表明糖尿病大鼠已有肾功能异常。给予金钗石斛干预后,金钗石斛3个剂量组的CysC和尿素氮含量均降低,β2-MG在RGZ组和金钗石斛MD组和HD组含量降低,并且金钗石斛HD组与RGZ组的CysC、尿素氮和β2-MG含量均差异无统计学意义,以上结果说明金钗石斛能够改善糖尿病大鼠肾功能,其中HD组作用较好。

笔者还观察到正常大鼠肾皮质中存在PPARγ表达,而STZ诱导的DN组大鼠肾皮质中PPARγmRNA和蛋白表达均降低。本研究各实验组在模型基础上分别给药12周后,Real-time PCR法和Western blot法检测糖尿病大鼠肾皮质中mRNA和蛋白表达,与DN组大鼠相比,MD组、HD组和RGZ组大鼠肾皮质中PPARγ表达量增高,随金钗石斛浓度增加,肾皮质中PPARγmRNA及蛋白表达量增高,其中HD组与RGZ组间差异无统计学意义。表明金钗石斛可以改善糖尿病模型大鼠肾脏中PPARγ表达的降低,使其表达量升高,其作用与RGZ组相似,与文献报道一致[2,5]。

综上所述,本实验结果显示赤水金钗石斛上调糖尿病大鼠肾皮质中PPARγ表达,在一定程度上减轻糖尿病模型大鼠肾脏病理损伤,改善了肾功能。由此推测金钗石斛使PPARγ在肾脏中的高表达可能对维持肾脏功能有一定作用,还可能参与了糖尿病的发展进程,从而达到对肾脏保护作用。本实验为赤水金钗石斛的开发及应用提供实验数据。糖尿病肾病发病机制复杂,除了调节PPARγ表达外,是否还存在其他机制有待进一步研究。

[1] 臧会玲,王春炅,杨吉春,等.PPARγ在糖尿病肾病中的保护作用[J].生理科学进展,2010,41(6):435-438.

[2] GAO D,LIQ,GAO Z,et al.Antidiabetic effects ofCorni Fructusextract in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Yonsei Med J,2012,53(4):691-700.

[3] 陶凤,金徽,杨贵忠,等.金钗石斛水提物对糖尿病大鼠肾组织非酶糖基化及氧化的影响[J].山东大学学报,2012, 50(10):11-15.

[4] 钱桂敏,章华泼.金钗石斛化学成分及药理作用研究进展[J].中国中医药现代远程教育,2011,9(4):194-196.

[5] BHATT J K,THOMAS S,NANJAN M J,et al.Resveratrol supplementation improves glycemic control in type 2 diabetes mellitus[J].Nutr Res,2012,32(7):537-541.

DOI 10.3870/yydb.2014.12.002

Effect of Dendrobium Nobile Lindl Decoction on Expression of PPARγin Diabetic Nephropathy Rat K idney

LIU Yuan-yuan,ZHANG Yan-lei,HE Xiao-ran,LIXiao-qiong,TANG Yan-ping
(Department of Biochemistry, ZunyiMedical College,Zunyi 563003,China)

Objective To explore the protective mechanism ofDendrobium nobile lindl(DNL)decoction on the expression of peroxisome proliferator activated receptor gamma(PPARγ)in the renal cortex of diabetic nephropathy(DN)rats.MethodsSixty SD ratswere randomly divided into six groups(n=10 per group)as follows:normal control group(NC), diabetic nephropathy controlgroup(DN),rosiglitazone group(RGZ),theDendrobium nobile lindllow(LD),medium(MD)and high(HD)dose groups.After DN rat model was established,the rats were administrated with respective medications for 12 weeks,respectively.The renal pathology of rats was observed.The mRNA and protein expression of PPARγin the renal cortex were detectedviaReal-time PCR and Western blotting,respectively.ResultsHigh dose DNL decoction significantly alleviated thickening of kidney tissue basementmembrane and fusion of foot process inmodel rats.The levels of PPARγmRNA and protein expression in the MD and HD groups were significantly increased as compared with the DN group(P＜0.05,P＜0.01).ConclusionDNL decoction can effectively reduce kidney injury by up-regulating the PPARγmRNA and protein expression in diabetic nephropathy rats.

Dendrobium nobile lindldecoction;Nephropathy,diabetic;Peroxisome proliferator activated receptorγ

R285.5;R587.1

A

1004-0781(2014)12-1545-04

2014-02-12

2014-04-16

*国家自然科学基金资助项目(30960509)

刘园园(1982-),女,黑龙江虎林人,硕士,主要从事药物分子生物学研究。电话:(0)13704828325,E-mail: liuyuanyuan110@163.com。

唐彦萍(1953-)女,贵州遵义人,教授,主要从事药物分子生物学研究。电话:0852-8609445,E-mail: tiantian8609445@163.com。