急性毒性藻红外测试中联合作用评价法的重现性

郭蔚华,钱建伟,吴玉龙,杨诚

重庆大学三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆400045

急性毒性藻红外测试中联合作用评价方法是新技术急性毒性藻红外测法的核心技术[1],该技术的稳定性将影响其应用前景,在应用之前必须认识其稳定性,而测试其重现性就是评价该技术稳定性的重要依据,因此开展急性毒性藻红外测试联合作用评价方法的重现性研究非常必要。目前,国内外进行了急性毒性藻红外测试中敏感藻的确定方法[2]、藻红外辐射测试环境重金属急性毒性[3]、藻红外辐射测试环境农药残留急性毒性[4]、藻红外辐射测试环境有机毒害物急性毒性[5]、急性毒性藻红外测试中联合作用的评价方法[1]、藻红外测试多元有机毒物急性毒性的初步分析[6]等研究,有关藻红外测试联合作用评价方法的重现性研究尚未见国内外报道。为此,开展了藻红外测试联合作用评价方法的重现性研究实验。

本文通过测试敏感藻(月牙藻[2])对5种有机药品不同组合的响应温差,用联合偏差系数法[1]分析联合作用类型的重现性,评价藻红外测试联合作用评价方法的稳定性。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

供试藻:羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)[2]作为测试用的敏感藻,由中国科学院武汉水生生物研究所提供。

供试药品:苯(C6H6)、甲苯(C7H8)、二甲苯(C8H10)、氯苯(C6H5Cl)、三氯甲烷(CHCl3),均为国产分析纯药品。

仪器设备:红外线测温仪,型号ST60,灵敏度0.1℃;LRH-250A生化培养箱;MOTIC BA200数码显微镜;80-2台式电动离心机;DR/5000U分光光度计等。

1.2 实验方法

测试原理:微型藻类具有光合磷酸化和氧化磷酸化的能量代谢系统,对毒害物质急性毒性响应的能量变化强于非光合微生物,微量毒物滴入藻液引起的藻能量变化可被红外测温仪测试。

重现性:用相同方法,同一试验材料,在不同的条件下获得的单个结果之间的一致程度。不同的条件指不同操作者,不同设备,不同实验室,不同或相同的时间[7]。

测试藻量标准及用量:叶绿素a作为测试藻量标准,对数生长期供试藻液叶绿素a≥4.0 mg·L-1,此时藻液用于测试[8],供试藻液5 mL。

测试环境:室内,自然光照,20～28℃。

测试容器:直径4 cm、高3 cm、厚0.2 cm的透明绝热塑杯。

测试用藻液量:当羊角月牙藻液处于对数生长期,且叶绿素a≥4.0 mg·L-1时,取藻液5 mL用于测试。

实验组设计:设加药组和对照组,各组3个重复,加药组所加药品分别为5种有机试剂按二元、三元、四元、五元等量混合的26个组合,各组合总药品量10 g·L-1。

药液配制:各加药组药液的单药量以总药品量除以元数计算得出:二元为5.0 g·L-1,三元为3.3 g·L-1,四元为 2.5 g·L-1,五元为 2.0 g·L-1。

测试方法:取培养好的藻液按每个容器5 mL,分别加入加药组和对照组的测试容器中,待藻液温度稳定后用红外测温仪对准藻液面中部测温记录,然后加药组、对照组分别滴加配制药液、蒸馏水各0.05 mL,立即对各藻液测温记录,每1.5 min测一次,连测8次,至10.5 min结束测温,取最大响应温差进行分析。

温差分析:根据每组测试温度,先计算出加药组和对照组的平均测试温度,再计算其最大响应温差(试验藻对毒物的响应温差)。

式中:Tp—加药组加药后测试的平均温度,Tp0—加药组加药前测试的平均温度,Tw—对照组加空白水后测试的平均温度,Tw0—对照组加空白水前测试的平均温度。

联合作用分析:用联合偏差系数法评价联合作用类型[5],即:

式中:θ—混合毒物引起敏感藻响应温差的联合作用系数;T—混合毒物引起敏感藻产生的绝对平均温差;TA、TB、TC…—混合毒物中单一毒物引起敏感藻产生的绝对平均最大温差。

(θi—联合偏差系数;f—总均偏差系数,f=0.06;TФ—毒性效应最强药品产生的温差;Tβ—联合作用温差;Tλ—相加作用的温差;f·Tλ—偏差温差)

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 重现性阈值

将温差偏差实验测试分析结果整理成表1[5],相加作用在1±f内的重现性为67%,以该数值作为藻红外联合作用重现性评价的阈值(Q)。

表1 温差偏差实验测试分析结果［5］Table 1 Experiments of temperature difference test and analysis

实验用苯(C6H6)、甲苯(C6H8)、二甲苯(C8H10)、氯苯(C6H5Cl)、三氯甲烷(CHCl3)和羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)进行重现性实验,以藻红外联合联合偏差系数法评价5种有机物对于羊角月牙藻的联合作用类型,并分析其重现性,重现性≥Q,稳定性好,重现性＜Q,稳定性差。分析结果整理为表2。

2.2 不同组合的平均重现性

二元组合的重现性:5种药品10个二元组合中,平均重现性为62.5%,小于阈值Q,表明二元联合作用的重现性差。其中,2-2、2-4、2-5、2-6、2-7 组合的重现性较好,2-1、2-3、2-8、2-9、2-10 组合的重现性差,较好与差各占50%。

三元组合的重现性:5种药品10个三元组合中,平均重现性为75%,大于Q,表明三元联合作用的重现性较好。其中,3-10组合的重现性差,3-6组合的重现性很好,其余组合的重现性较好,差、很好、较好的比例为10%、10%、80%。

四元的重现性:5种药品5个四元组合中,平均重现性为85%,大于Q,表明四元联合作用的重现性好。其中,4-3组合的重现性差,4-1组合的重现性较好,4-2、4-4、4-5组合的重现性很好,差、较好、很好的比例为20%、20%、60%。

五元的重现性:5种药品1个五元组合中,重现性为100%,大于Q,表明五元联合作用的重现性很好。

表2 5种有机毒物对羊角月牙藻的联合作用Table 2 Toxicity effects of five organic matters to Selenastrum capricornutum

上述分析中,重现性大于阈值的组合有19个,占26组合的73.1%。

2.3 联合作用的重现性变化

二元的重现性变化:由图1可知,拮抗的重现性在50% ～75%之间。其中,2-2、2-4、2-5、2-6、2-7 的拮抗重现性为75%,较好,其独立、相加的重现性为25%,较差;2-10拮抗的重现性是50%,其独立、协同的重现性各为25%;2-1、2-3、2-8、2-9、2-10 的拮抗或独立或相加的重现性各为为50%。

三元的重现性变化:由图2可知,拮抗的重现性50% ～100%之间,独立的重现性在0% ～50%之间。其中,3-10拮抗的重现性50%,3-6拮抗的重现性100%,其余8组合拮抗的重现性为75%。

四元的重现性变化:由图3可知,拮抗的重现性在50%～100%之间,独立的重现性在0% ～50%之间。其中,拮抗的重现性4-3为50%,4-1为75%,4-2、4-4、4-5 为100%。

五元药品的重现性变化:拮抗的重现性为100%。

上述分析可知,①二元组合中,尽管拮抗的重现性较好,但联合作用类型多样,②三元、四元、五元组合中,尽管拮抗的重现性较好,但联合作用类型减少。联合作用类型多样化与混合药品的元数高低成反相关的情况,尚待进一步分析。

2.4 药品组合元数增减的重现性变化

根据表2所作图4可知,联合偏差系数法评价平均重现性分别是,二元62.5% ＜三元75% ＜四元85%＜五元100%,表明药品组合元数的增减与联合作用的平均重现性正相关。

2.5 联合作用类型数的变化

5种药品的26个组合中,除了2-10出现3种联合作用类型(表2),其余每种组合4次测试出现两种联合作用类型,联合作用的4种类型未在同一组合同时出现,联合作用3种类型只在1个组合(2-10)中同时出现,表明联合作用类型的重现性是相对的。

从以上结果分析可以得到:

(1)在实验药液浓度测试中,重现性大于阈值的组合19个,占26组合的73.1%,联合作用的重现性较好,总平均藻红外联合作用评价法用于有毒有害物联合作用分析具有较好的稳定性。

(2)药品组合元数高低与联合作用的重现性正相关,即药品组合元数增加,联合作用的重现性增加,而与联合作用类型多样化反相关,其原因有待进一步研究。

(3)联合作用多种类型可在同组合的不同测试中出现,表明较好联合作用类型的重现性(总平均重现性73.1%)是相对的,急性毒性藻红外测试中联合作用评价方法的稳定性也是相对的。

图1 二元组合重现性Fig.1 Reproducibility in combinations of two drugs

图2 三元组合重现性Fig.2 Reproducibility of the combinations of four drugs

图3 四元组合重现性Fig.3 Reproducibility of the combinations of four drugs

图4 各元组合的平均重现性Fig.4 Average reproducibility of the combinations

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