L-丙氨酰-L-酪氨酸二肽化学合成研究

霍 婷，马洁珺，沈 宁，贾庆仪，刘骞峰

（西安瑞联近代电子材料有限责任公司，陕西 西安 710077）

L-丙氨酰-L-酪氨酸二肽化学合成研究

霍 婷，马洁珺，沈 宁，贾庆仪，刘骞峰

（西安瑞联近代电子材料有限责任公司，陕西 西安 710077）

以L-酪氨酸和L-丙氨酸为原料，苄氧羰基保护丙氨酸，甲酯保护酪氨酸，EDCI-HOBt法合成丙酪二肽，总摩尔收率(以酪氨酸计)为42%，结构经IR、APCI-MS、NMR表征。

L-酪氨酸；L-丙氨酸；二肽合成

酪氨酸是维持细胞生长必备的氨基酸之一，而丙酪二肽作为一种新型培养基的组成成分，其合成方法多为酶促合肽[1-3]，虽然反应效率较高，但由于酶的专一性和成本较高，不利于工业化。本文设计用甲醇保护的L-酪氨酸和氯甲酸苄酯保护的丙氨酸反应生成带保护基团的二肽，再通过碱解和加氢脱去保护基团，合成路线见图1，该方法反应条件温和，原材料价格低廉，具有一定的工业化价值。

图1 合成路线Fig.1 Synthetic route

1 试验部分

1.1试验试剂与仪器

试剂：L-丙氨酸和L-酪氨酸，1-羟基苯并三氮唑(HOBt)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)，纯净水为饮用水，其余试剂均为市售工业试剂。

仪器：LC-10ATVP液相色谱仪测定，TENSOR 27型傅里叶变换红外光谱仪(KBr压片)，LC-MS-2010EV质谱仪，Avanceav 500型核磁共振仪(CDCl3溶剂，TMS内标)。

1.2实验步骤

1.2.1 酪氨酸甲酯盐酸盐2的制备

向1L体系中加入甲醇600mL，冰盐浴降温至T＜0℃，缓慢滴加氯化亚砜31.6g，控温T＜0℃反应，滴毕，向体系加入L-酪氨酸40g，继续搅拌，撤去冰盐浴，缓慢加热至回流2h，降温至T＜50℃，减压浓缩得黄色粗品82g；甲醇/甲基叔丁基醚重结晶，得白色固体42g，收率82%，LC纯度99%。

1.2.2 Cbz保护丙氨酸3的制备

向2L体系中加入L-丙氨酸89.0g，12%氢氧化钠溶液900mL，冰盐浴降温至体系T＜0℃，缓慢滴加氯甲酸苄酯340g，滴毕自然升温至室温反应，不断补充氢氧化钠溶液，保持体系pH≈12反应，至pH无变化，缓慢加入18%盐酸溶液至pH≈8，加入乙酸乙酯洗涤水相至澄清，继续缓慢加入18%盐酸溶液至体系pH＜1，乙酸乙酯1200mL提取水相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得白色粗品300g；乙酸乙酯/石油醚重结晶得白色固体182g，收率81%，LC纯度94%，ESI-MS(m/z)： （222，M--H）。1.2.3 Cbz保护丙氨酰酪氨酸甲酯4的制备

向1L体系中加入酪氨酸甲酯盐酸盐39.3g，Cbz保护丙氨酸45.0g， HOBt 32.4g，四氢呋喃750mL，冰盐浴降温至体系T＜-5℃，缓慢滴加三乙胺20.2g，滴毕，控温T＜0℃继续搅拌30min，加入EDCl 45.8g控温T＜0℃反应，继续搅拌30min，撤去冰盐浴，自然升温至室温反应，体系中少量固体不溶，继续搅拌16h，浓缩反应液得黄色粘稠固体80g，溶入乙酸乙酯800mL，分别用饱和碳酸氢钠溶液和0.5mol·L-1盐酸溶液分次洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩得浅黄色粗品70g；乙酸乙酯/石油醚重结晶得白色固体55g，收率80%，LC纯度96%，ESIMS(m/z)：（401，M++H）。

1.2.4脱甲酯保护中间体5的制备

向500mL体系中加入Cbz保护丙氨酰酪氨酸甲酯35g，甲醇350mL，加热至40℃溶清，冷却至室温，缓慢滴加2mol·L-1氢氧化钠溶液220mL，滴毕，继续搅拌1h，缓慢加入2mol·L-1盐酸溶液调节体系pH=8～9，浓缩除去甲醇，向剩余水液加入2mol·L-1盐酸溶液调节体系pH＜1，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩得白色粘稠物35g，收率90%，LC纯度91 %，ESI-MS(m/z)：（387，M++H）。

1.2.5 L-丙氨酰-L-酪氨酸1的制备

向500mL体系中加入脱甲酯保护中间体5 22.0g，10% Pd/C 4.4g，甲醇和水的混合液920mL，通H2(约0.1MPa)反应2h，过滤除去Pd/C，滤液减压浓缩得白色粗品20g，甲醇和纯净水分别打浆30min，过滤，得白色固体17g，收率77%，LC纯度99%。

1.3产品鉴定

产品为白色晶体粉末，红外图谱如图2所示，与分子结构相符；ESI-MS(m/z)：（253，M++H）；1NMR（D2O,500MHz），δ：7.1（d，2H）；6.8（d，2H）；4.4（m，1H）；4.0（q，1H）；3.1（dd，1H）；2.9（dd，1H）；1.5（d，3H）。

2 结论

本文所用氨基酸保护基材料低廉，合肽采用EDCl-HOBt体系，后处理纯化方法简单且收率较高；加氢脱保护时用甲醇/水混合体系替代原有的单一溶剂体系，有效避免反应过程中产物析出附着Pd/C催化剂导致其失活，优化后的反应体系加氢时间仅为2h（常温20～30℃反应），反应完毕经简单后处理纯度即可达LC＞99%。该合肽方法条件温和，具有一定的工业化意义。

图2 L-丙氨酰-L-酪氨酸IR谱图Fig.2 IR spectrum of L-Alanyl-L-Tyrosine

[1] Kenzo Yokozeki,Kanagawa, et al. Novel peptide-forming enzyme,microbe producine the enzyme and method for producine peptide using them：US 2005/0032187[P], 2005-11-02.

[2] Ricca,Jean-Marc, et al. Selectivity and specificity in substrate binding to proteases: novel hydrolytic reactions catalysed by α-chymotrypsin suspended in organic solvents with low water content and mediated by ammonium hydrogen carbonate [J].J.Chem.Soc.Perkin Trans 1,1993(11)：1225-1234.

[3] Bergmann Fruton, et al. The influence of substrate structure on the kinetics of carboxypeptidase action[J].J.Biol. Chem.,1942(145):247-252.

Chemical Synthesis of L-alanyl-L-tyrosine Dipeptide

HUO Ting, MA Jie-jun, SHEN Ning, JIA Qing-yi, LIU Qian-feng
（Xi’an Ruilian Modern Electronic Chemicals Co. Ltd., Xi’an 710077, China）

Methanol was used to protect the carboxyl group of L-tyrosine, carbobenzoxy（Cbz）was selected as the amino protection group of L-alanine, and L-alanyl-L-tyrosine was obtained through the EDCI-HOBt dipeptide synthesis. The total yield was 42%, the structure was characterized by IR, APCI-MS and NMR.

L-alanyl；L-tyrosine；dipeptide synthesis

O 629.7

A

1671-9905(2014)02-0016-02

霍婷（1979-），女，甘肃天水人，工学硕士，西安瑞联近代电子材料有限责任公司工程师，从事医药中间体的合成研究。电话：15802977190，E-mail：huoting-714@163.com

2013-11-25