非寄主植物乙醇提取物对褐飞虱若虫的驱避与触杀活性

2014-05-08张献英王华杜尧东犹昌艳胡飞

生态环境学报 2014年2期

张献英，王华，杜尧东，，犹昌艳，胡飞*

1. 华南农业大学，广东广州 510642；2. 广东省气候中心，广东广州 510080

褐飞虱（Nilaparvata lugens Stal）具有远距离迁飞能力，对化学农药适应性强，传播病毒病，是东南亚地区水稻最主要害虫之一（娄永根和程家安，2011；曹奎荣等，2008；王荣富等，2000）。气候变化、水稻新品种的推广、肥水条件的改善和化学农药的长期大量使用，使得褐飞虱暴发频率增加，危害区域扩大，危害程度加重（程家安等，2008；Peng等, 2009）。长期以来褐飞虱的防治主要依赖于化学农药，使褐飞虱对目前各类常规杀虫剂产生了不同程度的抗药性(凌炎等，2011；王彦华等，2009)。开发高效、低毒、低残留、低抗性风险且具有良好环境效应的植物源农药是有效防治稻田褐飞虱危害的发展趋势之一（邓业成和徐汉虹，2005；祝增荣和程家安，2013）。植物次生物质对有害生物具有显著的生物活性，已有大量的报道。近年来以植物次生代谢产物为基础的植物源杀虫活性物质也屡见报道（方杰，2013；Vanichpakorn等, 2010；刘雨晴等，2010；顾庆龙等，2012；李秀梅和方继朝，2010；苏远萍等，2009），如菊酯、除虫菊素、苦参碱、鱼藤酮和烟碱等已商业化生产（贾明慧等，2012；邱德文，2013）。我国植物资源丰富,种类繁多，开发和利用植物源杀虫剂具有巨大潜力，而寻找新的杀虫植物资源是开发研究植物源杀虫剂的基础。本研究选用了在华南地区分布广泛，较易收集，生物量大的11种褐飞虱非寄主植物，采用冷浸提取法，获得乙醇提取物，通过对这些提取物对褐飞虱拒避作用和触杀活性的测定，以期获得具有开发潜力的抗褐飞虱杀虫植物资源，为开发研究新型环境友好的非化学合成的褐飞虱植物源杀虫剂提供参考。

表1 供试植物名录Table 1 Plant materials

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试水稻品种和昆虫

水稻为超级杂交稻组合“天优998”，将水稻种子催芽后分期分批播种于塑料盆钵中，至5~6叶期用于褐飞虱拒避和触杀试验。分蘖盛期用于饲养褐飞虱。

褐飞虱（Nilaparvata lugens（Stäl）），从华南农业大学试验田采集褐飞虱雌成虫，将收集的虫源放入室外网室内用处于分蘖期的“天优998”植株饲养产卵，待其种群繁殖到足够数量时，取3~4龄若虫作为供试昆虫。

1.1.2 供试植物

11种非寄主植物分属于8科11属（见表1）。

1.1.3 供试溶剂

无水乙醇（纯度≥99.7%）；丙酮（纯度≥99.5%），均为国药集团化学试剂有限公司生产。

1.1.4 供试仪器设备

高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；标准检验筛，40目孔径0.45 mm，浙江省上虞市华丰五金仪器有限公司；德国IKV RV10旋转蒸发仪，苏州博林格分析仪器有限公司；循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；电子分析天平 TE214S（精确度：0.0001 g），广州佰微科技有限公司；智能人工气候培养箱，浙江托普仪器有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 植物材料的提取

将表1中11种植物材料组织分别在60 ℃烘箱中烘干，用粉碎机粉碎后，过 40目筛，采用冷浸方法粗提。分别称取适量干样，加入5倍的无水乙醇溶剂置于避光处(20~25 ℃)，浸提48 h(期间间隔12 h摇晃15 min)过滤出溶液，再加入2.5倍无水乙醇，浸提24 h，过滤，合并2次滤液，用旋转蒸发仪浓缩，浓缩至再无溶剂滴出，将提取物放入通风橱(温度在20~25 ℃之间)至恒量为止。称量，密封保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 植物乙醇提取物对褐飞虱若虫驱避活性的测定

将1.2.1获得的提取物配成 10 mg·mL-1的乙醇提取物溶液。将按1.1.1方法培养的稻苗，剔除基部枯叶鞘和部分须根后选择大小相近的两株稻苗，用毛笔将乙醇提取物溶液均匀涂于稻茎上，两株水稻苗中，一株的茎秆用毛笔涂抹0.5 mL植物的乙醇提取物，另一株涂抹0.5 mL φ=95%乙醇作对照。按图1方法将涂了提取物溶液的水稻置于盛有营养液的塑料杯中，并在两苗的茎秆部位罩上带小孔的塑料杯罩（直径10 cm，上有24个直径小于褐飞虱身体大小的小孔），上端用纱布封口。30 min后，在塑料杯罩内接20头3~4褐飞虱若虫，然后置于控温（26 ±1）℃、控光（L∶D = 16 h∶8 h）的人工气候箱内，24 h 后观察记录两株稻苗上停留的褐飞虱数量。每个处理设3次重复。处理完成后计算褐飞虱的着落率和拒避率（赵善欢等，1983），计算方法如下：

图1 驱避活性测定装置Fig.1 Apparatus for testing of repellent activity

1.2.3 不同质量浓度植物乙醇提取物对褐飞虱若虫拒避或引诱活性的差异

根据1.2.2结果，花椒（Zanthoxylum bungeanum）和小茴香（Foeniculum vulgare）对褐飞虱若虫有显著地拒避作用，塞楝（Khaya senegalensis），胜红蓟（Ageratum conyzoides），桉树（Eucalyptus exsetrta）和毛麻楝（Chukrasia tabularis）对褐飞虱若虫有显著地引诱作用。用φ=95%的乙醇将各提取物稀释成5，10，20，30和40 mg·mL-15个不同质量浓度梯度，用1.2.2的方法，24 h 后记录褐飞虱在水稻植株上的着落数，分析不同质量浓度植物乙醇提取物对褐飞虱若虫拒避或引诱活性的差异。

1.2.4 植物乙醇提取物对褐飞虱若虫触杀活性的测定

参照苏远萍（2009）的药膜法。用丙酮将提取物分别配制成8 mg·mL-1药液，吸取0.5 mL药液装入1.5 cm×8.5 cm指形管，将指形管在桌面上来回滚动至药液完全阴干，使得指形管的底部和管壁上形成一层质量的药膜（质量浓度为95.69 μg·cm-2）。以丙酮为对照。每管接入褐飞虱3~4龄若虫30头，任其自由爬行1 h后转入1000 mL烧杯中，里面置有1株处分蘖期的水稻苗。用纱布封口，置于人工气候箱（28 ℃）中培养24 h后检查褐飞虱的死亡情况。褐飞虱死亡判断以细毛笔触及足和触角等附肢完全不动为死亡。重复3次。处理完成后计算校正死亡率。

对照死亡率≤5%时：校正死亡率=处理死亡率-对照死亡率

5%≤对照死亡率≤20%时：则校正死亡率按下式计算：

1.2.5 不同质量浓度植物乙醇提取物对褐飞虱若虫触杀活性差异

根据1.2.4结果，在质量浓度为95.69 μg·cm-2时辣椒（Capsicum annuum）、小茴香、花椒、胜红蓟和鬼针草（Bidens pilosa）对褐飞虱若虫触杀死亡率达85%以上，进一步对以上5种植物不同质量浓度的乙醇提取物触杀效果进行评价，分析植物提取物质量浓度与对褐飞虱若虫触杀活性的关系。

用丙酮将各提取物稀释成 1，2，4，6和 8 mg·mL-15个不同质量浓度，相当于均匀涂指形管内壁的量为：11.97，23.91，47.82，71.74和 95.69 μg·cm-2。按1.2.4方法，24 h 后记录褐飞虱死亡数，重复3次。

1.4 数据处理

利用Microsoft Office Excel 2010、SPSS19和DPS 7.5统计软件对数据进行统计分析，用LSD最小显著差数法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 植物提取物对褐飞虱若虫拒避活性的测定

在11种植物的乙醇提取物中，共有2种植物提取物，花椒和小茴香，对褐飞虱3~4龄若虫有明显地拒避活性，褐飞虱在这2种植物提取物处理稻株上的数量明显低于其相应对照株(图2)。24 h后，它们对褐飞虱若虫的拒避率分别为53.3%和43.3%。有4种植物提取物，塞楝、胜红蓟、桉树和毛麻楝，对褐飞虱3~4龄若虫有明显地引诱活性，褐飞虱在这些植物提取物处理稻株上的数量明显高于其相应对照株上。24 h后，褐飞虱若虫在其稻株上的着落率分别为75.0%、73.3%、73.3%和71.7%。其它植物提取物对褐飞虱若虫没有显著地拒避与引诱作用。因此，在10 mg·mL-1的质量浓度下，花椒和小茴香乙醇提取物对褐飞虱3~4龄若虫有显著地拒避活性；塞楝、胜红蓟、桉树和毛麻楝乙醇提取物对褐飞虱3~4龄若虫有显著地引诱活性。

2.2 不同质量浓度植物乙醇提取物对褐飞虱若虫驱避活性的差异

2.2.1 不同质量浓度植物乙醇提取物对褐飞虱若虫拒避作用的差异

根据2.1结果，进行了不同质量浓度的花椒和小茴香乙醇提取物对褐飞虱若虫拒避差异的分析，结果表明，当花椒和小茴香乙醇提取物质量浓度≥10 mg·mL-1时，对褐飞虱若虫均具有显著地拒避作用(图3)，两个植物乙醇提取物对褐飞虱若虫的拒避作用均随浓度的升高而增加，相同质量浓度下作用效果相近。花椒提取物在40 mg·mL-1时，24 h后，拒避率高达66.7%（图3），小茴香提取物在40 mg·mL-1时拒避率高达60.0%（图3）。

图3 褐飞虱若虫在分别涂有不同质量浓度花椒和小茴香乙醇提取物水稻植株上的着落率Fig.3 Landing rate of BPH nymphs on rice plants pasted with different concentrations of Z. bungeanum or F. vulgare ethanol extracts

图2 褐飞虱若虫在涂有不同植物乙醇提取物水稻植株上的着落率Fig.2 Landing rate of BPH nymphs on rice plants pasted with different plant extracts.

2.2.2 不同质量浓度植物提取物对褐飞虱若虫引诱作用的差异

根据2.1的结果，塞楝、胜红蓟、桉树和毛麻楝4个植物乙醇提取物对褐飞虱若虫有引诱作用。不同质量浓度下这些植物乙醇提取物对褐飞虱若虫引诱差异分析试验的结果表明，其对褐飞虱若虫的引诱作用均随浓度的升高因植物种类不同而有差异（图4）。楝科的2个植物，塞楝和毛麻楝，在10 mg·mL1时，对褐飞虱若虫具有显著地引诱作用，24 h 后，着落率分别达到75.0%和71.7%；在40 mg·mL-1时，对褐飞虱若虫具有显著地拒避作用，24 h 后，拒避率分别为50.0%和40.0%。

胜红蓟乙醇提取物在5和10 mg·mL-1时对褐飞虱若虫具有显著地引诱作用，24 h后，着落率分别为71.7%和73.3%，当质量浓度20 mg·mL-1以上后时对褐飞虱若虫没有显著地影响（图4）。桉树提取物在10和20 mg·mL-1时对褐飞虱若虫具有显著地引诱作用，24 h后，着落率分别为73.3%和71.7%，当质量浓度在30 mg·mL-1以上后对褐飞虱若虫没有显著地影响（图4）。

2.3 植物提取物对褐飞虱若虫触杀作用

由表2可知，按照Chandravadana等（1996）分级标准，以95.69 μg·cm-2处理时，供试的11种植物提取物中辣椒、小茴香、花椒、胜红蓟和鬼针草提取物对褐飞虱若虫的触杀活性高，在处理24 h后褐飞虱校正死亡率均大于85%，且这5种植物乙醇提取物间对褐飞虱的触杀效果没有显著差异。塞楝和蟛蜞菊（W.chinensis）对褐飞虱若虫的触杀活性，在处理24 h后褐飞虱校正死亡率均在50%以上，两者之间差异不显著。枸树乙醇提物活性较弱，在处理24 h后褐飞虱校正死亡率仅为22.22%。毛麻楝、马樱丹和桉树乙醇提取物对褐飞虱若虫的触杀活性均小于10%。因此，95.69 μg·cm-2的质量浓度处理下，辣椒、小茴香、花椒、胜红蓟和鬼针草乙醇提取物对褐飞虱若虫具有良好的触杀活性，塞楝和蟛蜞菊次之。

图4 褐飞虱若虫在分别涂有不同质量浓度塞楝、毛麻楝、胜红蓟和桉树乙醇提取物水稻植株上的着落率Fig.4 Landing rate of BPH nymphs on rice plants pasted with different concentrations of K. senegalensis , C. tabulari , A. conyzoides ,and E. exsetrta ethanol extracts respectively

表2 11种植物乙醇提取物对褐飞虱若虫的触杀作用（95.69 μg·cm-2）Table 2 The contact toxicity of ethanol extracts of 11 non-host plant species on BPH instar nymphs

2.4 不同质量浓度植物提取物对褐飞虱若虫触杀作用

以药膜法测定了5种植物提取物对褐飞虱若虫的触杀活性。表3显示随着5种植物乙醇提取物剂量的升高，褐飞虱若虫的校正死亡率也逐渐增高。低剂量处理时，辣椒的效果最好；高剂量处理时，各提取物的效果相当。

根据乙醇提取物质量浓度与触杀效果的关系，建立了线性回归方程（表4）。根据所得方程，处理24 h后，辣椒，小茴香，花椒，胜红蓟和鬼针草的LD50分别为15.4624，25.6621，33.6147, 33.5650和37.8468 μg·cm-2。可见辣椒提取物的触杀效果最强，其次为小茴香、胜红蓟、花椒和鬼针草提取物。

3 讨论

非寄主植物乙醇提取物对褐飞虱具有显著拒避或触杀作用的植物与其在分类上关系不明显，如同是楝科的毛麻楝和塞楝差异很大。但菊科植物具有较高的活性，例如，同是菊科的胜红蓟、鬼针草、和蟛蜞菊对褐飞虱的触杀校正死亡率均大于 50%（表2）。

表3 不同质量浓度5种植物乙醇提取物对褐飞虱的触杀作用Table 3 Contact toxicity of ethanol extracts of 5 plant species on BPH nymphs

表4 植物乙醇取物对褐飞虱若虫触杀效果与质量浓度的关系Table 4 Relations of contact toxicities with concentrations of extracts from different plants to BPH nymphs

3.1 非寄主植物的乙醇提取物对褐飞虱若虫的拒避和引诱作用规律

非寄主植物乙醇提取物对褐飞虱若虫的拒避和引诱作用因植物种类和提取物的质量浓度而变化。花椒和小茴香的乙醇提取物对褐飞虱若虫的拒避作用明显，并且随着质量浓度的升高拒避作用随之增加（图3），与文献结果一致（刘胜宁等，2011）。

塞楝和毛麻楝乙醇提取物在较低质量浓度下显示引诱作用，当质量浓度增加到40 mg·mL-1时显示出显著地拒避作用。胜红蓟乙醇提取物随质量浓度升高也由引诱向拒避作用转变，只是在实验质量浓度内拒避作用还不显著，但趋势明显。桉树乙醇提取物随着质量浓度的升高对褐飞虱若虫引诱作用减弱（图4）。这表明，非寄主植物乙醇提取物对褐飞虱引诱作用只会在部分植物乙醇提取物较低质量浓度下才有可能出现，随着质量浓度的增加，大多数非寄主植物乙醇提取物对褐飞虱都会产生拒避作用。一般认为褐飞虱受水稻挥发物引诱而取食水稻，本研究表明，褐飞虱对非寄主植物具有普遍的拒食效应，可能解释了褐飞虱只对水稻产生危害的原因。

3.2 非寄主植物乙醇提取物对褐飞虱若虫的触杀活性规律

在所选的11种植物中辣椒、小茴香、花椒、胜红蓟、鬼针草、塞楝和蟛蜞菊7种植物乙醇提取物（95.69 μg·cm-2）对褐飞虱若虫触杀的24 h校正死亡率大于50%，其中辣椒、小茴香、花椒、胜红蓟和鬼针草乙醇提取物对褐飞虱若虫触杀的24 h校正死亡率大于85%以上（表2），且24 h校正死亡率均随着乙醇提取物质量浓度的增加而增加（表3）。除花椒的乙醇提取物对褐飞虱触杀作用有文献报道外（苏远萍等，2009），其他植物乙醇提取物对褐飞虱若虫触杀效果则是首次报道。

植物的不同部位含有不同的化学成分或活性成分浓度不同，因而导致不同部位对试虫的生物活性不同（吴敏，2006；刘序铭，2008）。有研究表明蟛蜞菊的茎叶提取物对稻纵卷叶螟没有毒杀作用，但是花提取物对稻纵卷叶螟若虫有较好的毒杀作用（顾庆龙等，2012）。本研究显示蟛蜞菊乙醇提取物（95.69 μg·cm-2）对褐飞虱若虫触杀的24 h校正死亡率达56.67%，与前5种植物相比较低，可能与本研究采集的蟛蜞菊地上部分，主要是茎和叶，花的量相对较低有关。

3.3 非寄主植物乙醇提取物拒避、引诱和触杀作用之间的相互关系

在试验质量浓度下非寄主植物乙醇提取物对褐飞虱若虫都是拒避作用，其触杀作用效果显著，相同质量浓度下拒避作用越强，其触杀效果也越明显，产生引诱作用的质量浓度越大，其触杀效果也随之下降（图3，表2, 3）。

辣椒、小茴香和花椒对褐飞虱的拒避和触杀作用都很明显，但他们都是植物的果实，本身具有较高的经济价值，虽然具有开发成植物源农药来防治褐飞虱的潜力，但直接应用经济上是不可取的。对这3种果实乙醇提取物进行进一步的分离鉴定，找出其主要的活性成分，并加以人工模拟合成是可能的开发途径。

胜红蓟和鬼针草是南方地区广泛分布的入侵略杂草，对农林和自然生态系统均境构成了危害（郝建华等，2009），是需要防除的杂草，其分布广，生物量大，生长迅速，方便采收。因此，直接运用这些植物进行简单的提取，直接应用可能会具得良好经济和生态效益。

另外有研究显示，植物源物质（如印楝素）的施用，可以导致水稻挥发物组分和相对含量发生明显变化（卢海燕等，2010），而胜红蓟和鬼针草均有化感作用，对水稻和稻田杂草均有可能产生抑制作用（郭艾英等，2010）。尽管化感作用主要对水稻的萌发和幼苗产生危害，且褐飞虱的危害主要在水稻分蘖期以后，化感物质在土壤环境中降解快，不会产生富集（孔垂华等，2002；肖辉林等，2006），另外，由于防治飞虱是通过喷施实现的，进入土壤的量相对较少，对水稻根系产生的影响有限，因此，推测胜红蓟和蟛蜞菊乙醇提取物对分蘖期以后的水稻不会产生显著的化感抑制作用。然而进一步分析胜红蓟和鬼针草乙醇提取物在有效防控褐飞虱浓度下对水稻的影响，仍是必要的。具有杀虫活性的非寄主植物提取物对水稻植株的影响是其能否被应用的限制因素，最好与杀虫活性同步进行研究。

另外，具有植物乙醇提取物对褐飞虱拒避和触杀效果的作用方式和作用机理有待进一步研究。

4 结论

本研究所选11种不同科属非寄主植物的乙醇提取物在一定质量浓度下，对褐飞虱均会产生不同程度的拒避作用。其中辣椒、小茴香、花椒、胜红蓟和鬼针草乙醇提取物对褐飞虱若虫的触杀活性达到85%以上。其中辣椒、小茴香、花椒属于经济作物，本研究表明，这3种作物还具体开发为生物农药的价值。胜红蓟和鬼针草在华南地区分布广泛，易采集，植物资源丰富，具有开发成植物源杀虫剂的巨大潜力。

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