海参多糖对环磷酰胺诱导生殖系统受损小鼠生精功能的影响

高 林，高 华，葛明东

(1青岛大学医学院药学院，山东青岛266021;2高密市人民医院)

近年来，氧自由基在各种疾病发病机制中的作用倍受重视。精子膜脂质中的多不饱和脂肪酸能与自由基发生脂质过氧化作用，损伤精子膜，使精子活力下降以至丧失［1，2］。环磷酰胺(CP)是一种双功能细胞毒性烷化剂，对生殖系统，尤其对生精功能有损害。研究证实，自由基损伤机制与CP引起的生精功能障碍关系密切［3，4］。多糖类化合物具有提高免疫力、抗氧化和抑制肿瘤生长的作用［5～7］，但很多研究是针对真菌多糖类和植物多糖类［8，9］，很少对动物多糖进行研究。2012年11月～2013年6月，我们利用从海参中提取的海参多糖(PSC)饲养小鼠，以睾丸的生精作用和抗氧化指标为参数，初步观察了PSC在CP使用过程中对生殖系统的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 昆明种雄性小鼠40只，鼠龄10～12周，体质量25～35 g，购于山东省鲁抗医药股份有限公司;室温下饲养，自由饮水和摄食。质量分数0.95的PSC，青岛大学药学院制备;生理盐水，辰欣药业股份有限公司;总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒，南京建成生物工程研究所;注射用CP(0.2 g/瓶)，江苏恒瑞医药股份有限公司。AR5120型电子天平，奥豪斯国际贸易上海有限公司;DK-98-1型电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司;生物摄像显微镜B1系列，麦克奥迪实业集团有限公司;LD4-2A型低速离心机，北京雷勃尔离心机有限公司;723N型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制备与分组处理 将40只小鼠随机分成A、B、C、D组各10只，A组腹腔注射生理盐水，其他各组均腹腔注射CP 28 mg/kg，每天1次，连续5 d;同时，C、D 组分别给予 PSC 300、600 mg/kg灌胃，A、B组给予同体积的蒸馏水灌胃，每天1次，连续4周。

1.2.2 精子采集与指标分析 末次给药24 h后，脱颈椎处死小鼠;快速剥离附睾并称重，加入0.5 mL生理盐水后剪碎;37℃水浴温育5 min，游离附睾中的精子制成悬液。取25 μL精子悬液滴于血球计数板上，计算精子总数和运动率;另取10 μL精子悬液滴在载玻片上，伊红染色，显微镜观察，计算精子畸形率。

1.2.3 睾丸组织中蛋白质水平及T-SOD活力测定快速取出一侧睾丸，按质量(g)、体积(mL)比1∶9加入生理盐水;冰水浴条件下匀浆，制备成10%的匀浆液;以2 500～3 000 r/min离心10 min，取上清液。考马斯亮蓝法测定匀浆中的蛋白质，羟胺法测定TSOD活力。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。数据以±s表示，进行单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组生存状态观察 A组一般情况良好，运动活泼有力，反应敏捷，食欲健旺;鼠毛柔顺浓密有光泽，肌肉发达，体质量维持在一定水平并逐渐增长。而其他各组腹腔注射CP后，进食减少，萎靡少动;并且，毛色干枯发黄无光泽，体质量均出现了一定程度减轻。C、D组体质量均有不同程度增长，其中D组增长较为明显。

2.2 各组精子指标比较 见表1。

表1 各组小鼠精子密度、运动率及畸形率比较(n=10，±s)

表1 各组小鼠精子密度、运动率及畸形率比较(n=10，±s)

注:与A 组比较，*P ＜0.05，#P ＜0.01;与B 组比较，○P ＜0.01;与 C 组比较，△P ＜0.05，□P ＜0.01

组别 精子密度(×107/mL)精子运动率(%)精子畸形率(%)A组4.417 ±0.417 47.50 ±4.37 30.33 ±1.63 B 组 2.133 ±0.509# 28.33 ±6.31# 36.67 ±0.82#C 组 4.083 ±0.293○ 40.83 ±2.93＊○ 32.00 ±1.41＊○D 组 4.590 ±0.290○△ 50.67 ±4.55○□ 31.67 ±1.21○

2.5 各组睾丸组织蛋白水平及T-SOD活力比较见表2。

表2 各组睾丸组织蛋白水平及T-SOD活力比较(n=10，±s)

表2 各组睾丸组织蛋白水平及T-SOD活力比较(n=10，±s)

注:与A 组比较，*P ＜0.01;与B 组比较，#P ＜0.05，△P ＜0.01;与 C 组比较，○P ＜0.05

组别 10%蛋白水平(g/L) T-SOD(U/mgprot)A组6.55 ±0.91 46.38 ±6.30 B 组 5.30 ±0.23* 38.59 ±4.73*C 组 6.07 ±0.21# 53.30 ±6.28△D 组 6.77 ±0.59△○ 56.89 ±4.71*

3 讨论

随年龄增加，机体清除自由基的能力降低，打破了氧化—抗氧化系统的平衡，主要表现为氧化作用增强、抗氧化能力减弱;自由基过量后产生过氧化脂肪，从而引起机体损伤［10］。CP作为临床上常用的抗肿瘤药物和免疫抑制剂，其致生精功能损害已为众多基础及临床研究所证实［11］。研究报道，CP诱导睾丸生精障碍的机制主要有:①损伤生殖细胞遗传物质，诱导生精细胞凋亡;②干扰A型精原细胞自我更新增殖和分化功能;③破坏精子发生微环境，包括生精小管细胞层数减少，结构紊乱，Sertoli细胞形态变化，生殖细胞脱落，精子发生障碍;④抑制睾丸3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)和17β-HSD的活性，从而降低血清睾酮水平，减少生殖细胞数目［12］。

睾丸是产生精子和分泌睾酮的重要器官，生精小管是产生精子的部位。CP对睾丸氧化性损伤的最直接表现就是破坏睾丸的生精功能。本研究发现，B组小鼠精子数量和运动率降低，并且畸形率增高［13，14］;而PSC能减轻CP的毒性作用，有效提高精子数量，降低畸形率，一定程度保护了小鼠的生殖功能;并且随剂量的增加，缓解作用有增强的趋势。另外，B组小鼠睾丸组织T-SOD活性显著降低，提示CP可导致睾丸组织细胞中氧自由基生成增多，T-SOD被大量消耗，不能使过量生成的自由基得以清除，从而加重了脂质过氧化程度，使氧化—抗氧化系统失衡、生殖细胞损伤及代谢障碍，进而损伤生殖系统。与B组比较，给药各组小鼠睾丸组织T-SOD活性显著增高，说明PSC能提高睾丸组织T-SOD活性，提高组织细胞抗氧化和清除自由基的能力，有效抑制CP对小鼠睾丸组织中氧化抗氧化系统的破坏。

综上所述，PSC可以缓解CP对昆明小鼠的生殖毒性，提高睾丸组织的抗氧化能力，一定程度保护其生殖功能。PSC作为一种天然多糖，值得进一步研究开发利用。

［1］寇素茹，谢雪兰，段斐，等.锌对小鼠睾丸组织NO的含量及抗氧化作用的影响［J］.现代预防医学，2008，35(19):3855-3857.

［2］靳镭，陈守真.冬虫夏草对抗环磷酰胺致小鼠睾丸氧化损伤的作用［J］.中国妇幼保健，2008，23(13):1858-1860.

［3］Montironi R.Intratubular germ cell neoplasia of the testis:testicular intraepithelial neoplasia［J］.Eur Urol，2002，41(6):651-654.

［4］Van den Berg H，Furstner F，van den Bos C，et al.Decreasing the number of MOPP courses reduces gonadal damage in survivors of childhood Hodgkin disease［J］.Pediatr Blood Cancer，2004，42(3):210-215.

［5］万安韬，张林存，程星宇，等.香菇多糖对罗非鱼非特异性免疫力的影响［J］.江苏农业科学，2012，40(4):225-227.

［6］刘娜，朱蓓薇，孙黎明，等.鲍鱼性腺多糖的体内抗氧化活性［J］.大连工业大学学报，2011，30(3):177-179.

［7］Zhou F，Zhou H，Wang T，et al.Epigallocatechin-3-gallate inhibits proliferation and migration of human colon cancer SW620 cells in vitro［J］.Acta Pharmacol Sin，2012，33(1):120-126.

［8］朱永飞，曹磊，闫素清，等.四种真菌复合多糖抗氧化与抗肿瘤作用观察［J］.郑州大学学报(医学版)，2011，46(2):253-256.

［9］牛娟娟，宋扬.海洋刺参多糖对宫颈癌细胞周期的影响及其机制［J］.齐鲁医学杂志，2010，25(5):386-388.

［10］叶锦霞.红花水提物的抗氧化作用及ESR波谱研究［D］.北京:中国中医科学院中西医结合基础硕士学位论文，2008:16-18.

［11］陈守真，靳镭.冬虫夏草对抗环磷酰胺致小鼠生精障碍的作用［J］.中国优生与遗传杂志，2007，15(11):93-94，98.

［12］刘静，于洪升，朱静娟，等.低剂量辐射对环磷酰胺所致小鼠DNA及遗传物质损伤的影响［J］.青岛大学医学院学报，2008，44(1):44-47.

［13］ Elangovan N，Chiou TJ，Tzeng WF，et al.Cyclophosphamide treatment causes impairment of sperm and its fertilizing ability in mice［J］.Toxicology，2006，222(1/2):60-70.

［14］Codrington AM，Hales BF，Robaire B，et al.Exposure of male rats to cyclophosphamide alters the chromatin structure and basic proteome in spermatozoa［J］.Human Reproduction，2007，22(5):1431-1442.