急性脑梗死患者MTHFR基因多态性与血浆同型半胱氨酸水平的关系

蒋 萍，臧大维

(1天津医科大学，天津300070;2天津市第一中心医院)

同型半胱氨酸(Hcy)是一种含硫氨基酸，参与 甲基循环，通过蛋氨酸及半胱氨酸脱甲基代谢形成。动脉粥样硬化(AS)是缺血性脑卒中的重要病理基础，血浆Hcy水平升高可能是缺血性脑卒中的独立危险因素，可能作用于AS过程及血栓形成前过程［1］。基因和环境因素(如叶酸、维生素 B12的摄入)都会影响血清Hcy水平。5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是蛋氨酸循环中的一个关键酶，MTHFR基因在677位点发生突变会影响血清Hcy水平［2］，有 CC(野生型)、CT(杂合突变型)和 TT(纯和突变型)3种类型［3］。脑梗死患者中普遍存在高同型半胱氨酸(HHcy)［4］，不同国家、地区血浆 Hcy基础水平不同，MTHFR基因多态性亦存在差异。流行病学资料显示，如果Hcy水平过高，脑中风危险性增大。大多实验显示，MTHFR基因C677T突变是HHcy成因之一;也有研究指出，1个基因位点的突变并不一定使血浆Hcy水平产生显著性改变，所以MTHFR基因多态性与Hcy水平相关性仍无定论。本研究在急性脑梗死(ACI)患者中进行MTHFR基因多态性分析，并同时测定血浆Hcy、叶酸、维生素B12、尿酸(UA)水平，探讨ACI患者MTHFR基因多态性对Hcy水平的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入标准:①ACI符合《全国第四届脑血管病学术会议修订》的标准，并经头颅CT和(或)MRI证实;②所有入组者为天津地区汉族居民，女性均为绝经后妇女。排除标准:有冠心病、慢性胃肠道疾病、肾功能不全、甲状腺疾病、恶性贫血、肿瘤病史、慢性房颤、下肢静脉血栓等病史，以及有甲氨蝶呤、茶碱、磷酸二酯酶抑制剂、B族维生素、叶酸服用史。选择2012年12月～2013年3月天津市第一中心医院神经内科住院符合纳入排除标准的ACI 48例，男29例、女19例，年龄43～87(65 ±10)岁;高血压病42例，糖尿病29例，有吸烟史20例，饮酒史9例。

1.2 方法

1.2.1 血浆Hcy测定 入院后第2天取清晨空腹静脉血2 mL，分离血浆;应用Roche P800全自动生化分析仪以循环酶法测定血浆Hcy，试剂盒购自北京森美希克玛生物科技有限公司。Hcy参考值0～10 μmol/L，Hcy ＞ 10 μmol/L 即为 HHcy，10 ～ 30 μmol/L轻度增高、31～100 μmol/L中度增高、＞100 μmol/L重度增高。

1.2.2 血清叶酸、维生素B12、UA测定 入院后第2天取清晨空腹静脉血2 mL，分离血清;用ELECSYC-2010型全自动电化学发光免疫分析仪(德国罗氏公司)以化学发光法检测叶酸、维生素B12，试剂为装配套试剂。血清叶酸参考值3.5～13 ng/mL，维生素B12参考值300～800 pg/mL。用日立7080生化仪检测UA，参考范围208～428 μmol/L(男)，155 ～357 μmol/L(女)。

1.2.3 MTHFR基因C677T检测 取受检者静脉血2 mL，EDTA抗凝，提取人类白细胞基因组DNA(试剂由深圳奥萨制药有限公司提供)。应用多聚酶链反应2-限制性内切酶片段长度多态性技术(PCR2-RFLP)扩增MTHFR基因目的片段，PCR反应体系为25 μL，常规配制。循环周期依次为94℃30 s、65 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，3 循环周期后72 ℃再延伸7 min。扩增产物由识别多态性位点的特异核酸内切酶在37℃酶切1 h。2%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，根据电泳条带区分基因型。C/C为仅有274 bp片段，C/T为酶切后既有274 bp又有228 bp片段，T/T有228 bp片段。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料采用±s表示，多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(One Way ANOVA);进一步进行组间两两比较，若方差齐采用SNK检验，若方差不齐采用Games-Howell检验;计数资料采用χ2检验。对基因频率在人群中分布进行H-W平衡吻合度检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTHFR基因频率及等位基因频率 48例ACI患者中，C/C 型 17例(35.43%)，C/T型 27例(56.32%)，T/T 型 4 例(8.25%);C 等位基因频率63.59%，T等位基36.41%。基因分布频率符合H-W基因分布规律，见图1。

图1 MTHFRC677T基因PCR-RFLP检测结果

2.2 不同MTHFR基因型患者ACI传统危险因素比较 MTHFR基因C/C型男10例、女7例，年龄(64±7)岁;有高血压15例、糖尿病17例、吸烟7例、饮酒5 例;纤维蛋白原(FIB)为(3.00 ±0.52)g/L，TC(6.149 ± 1.37)mmol/L，TG(1.55 ± 1.44)mmol/L。C/T型男16例、女11例，年龄(64±11)岁;有高血压24例、糖尿病11例、吸烟11例、饮酒3例;FIB(2.86 ±0.60)g/L，TC(6.07 ±1.74)mmol/L，TG(1.52 ±0.87)mmol/L。T/T 型男 3 例、女 1例，年龄(67±5)岁;有高血压3例、糖尿病1例、吸烟2 例、饮酒1 例;FIB(3.27 ±0.35)g/L，TC(5.24±0.59)mmol/L，TG(1.04 ±0.13)mmol/L。3 种基因型患者ACI传统危险因素比较，P均＞0.05。

2.3 MTHFR基因多态性与血浆Hcy水平的关系MTHFR基因 C/C、C/T、T/T患者血浆Hcy分别为(15.78 ±13.60)、(22.81 ± 15.70)、(72.18 ± 62.54)μmol/L，T/T较C/T、C/C血浆Hcy水平显著增高(P均 ＜0.05)。

2.4 不同血浆Hcy水平与MTHFR基因型的关系血浆 Hcy正常者中 MTHFR基因 C/C、C/T、T/T分别为5、3、0 例，轻度增高者分别为 11、18、1 例，中度增高者分别为1、6、3例。Hcy轻度增高较正常范围的MTHFR基因型分布无显著差异，中度较轻度增高的MTHFR基因型分布有显著差异(P＜0.05)。

2.5 MTHFR基因多态性与血清叶酸、维生素B12、UA的关系 不同MTHFR基因型ACI患者血清叶酸、维生素 B12、UA 比较，P 均 ＞0.05。见表1。

表1 MTHFR基因多态性与叶酸、维生素B12、UA 水平的关系(±s)

表1 MTHFR基因多态性与叶酸、维生素B12、UA 水平的关系(±s)

基因型 叶酸(ng/mL) 维生素B12(pg/mL)UA(μmol/L)C/C 6.97 ±3.17 392.89 ±182.82 301.51 ±93.14 C/T 5.63 ±3.52 334.86 ±116.40 297.61 ±66.87 T/T 5.38 ±2.51 349.75 ±141.98 261.30 ±70.09

3 讨论

目前认为ACI的危险因素包括不可干预因素(高龄、性别)和可干预因素(BMI、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、高脂血症)［5］，但临床上许多AS性脑梗死患者并无上述传统危险因素。自1969年MeCully提出Hcy可能与AS相关以来，国内外学者围绕该问题开展了大量的研究。越来越多的研究表明，HHcy与脑卒中的发生、发展密切相关，Hcy水平轻至中度增高是脑卒中的独立危险因素之一［6～8］。

Hcy是蛋氨酸经脱甲基后生成的一种含硫氨基酸，为蛋氨酸和半胱氨酸代谢的中间产物。蛋氨酸在ATP酶作用下转化为S-腺苷蛋氨酸(SAM)，再经甲基转移转化为S-腺苷Hcy，后去腺苷即生成Hcy。正常成人血浆Hcy浓度为5～10 μmol/L。据最新标准，人体血中 Hcy ＞ 10 μmol/L 称为 HHcy［9］。Hcy在体内的代谢途径主要有3条，其中再甲基化途径占50%，其余为转硫途径或直接释放到细胞外液。Hcy再甲基化途径需要叶酸和维生素B12参与:在蛋氨酸合成酶(MS)作用下，以维生素B12为必需辅助因子，5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)作为甲基供体，再甲基化合成蛋氨酸。甲基供体由MTHFR作用于5，10-亚甲基四氢叶酸(5，10-MTHF)形成。

MTHFR cDNA全长 2.2 kb，定位于染色体1p36.3，包括11个外显子和10个内含子。MTHFR是一种黄素蛋白，是Hcy代谢途径中的关键酶之一，将5-MTHF还原为甲基四氢叶酸，参与Hcy再甲基化过程。理论上，该酶活性下降可使血浆Hcy升高。Frosst等报道了MTHFR基因一个较为常见的错义突变C677T，MTHFR基因 C677T突变后产生C/C、C/T、T/T 3 种基因型［10］。后来研究发现，MTHFR基因至少有6个位点易发生C→T碱基突变，分别位于 559、677、692、985、1 015、1 081 处，其中第4外显子的C677T位点碱基突变最为常见，其纯合突变可作为HHcy一个重要的遗传因素。MTHFR基因C677T在世界范围内具有相对较高的突变率，且在人群中呈多态性分布。已有的研究表明，MTHFR基因C677T在不同国家、同一国家不同地区、同一地区不同民族或种族中的分布有显著性差异。据报道，在白种人群T/T可高达8%［11］，在黑人中分布频率最低(＜2%)［12］。对中国汉族、布依族、苗族的研究发现，该位点突变基因型频率和基因频率均具有种族差异［13］。

据最新对汉族人群(15 357名)进行筛查的结果，MTHFR基因的T等位基因出现率及T/T突变率南方(海南)较北方(山东)低，分别是24.0%、6.4%和 63.1%、40.8%，其中天津大港地区数值较高为 54.3%、30.4%［14］。本研究选取天津市区 ACI人群为研究对象，48例患者中MTHFR基因C/C型35.43%、C/T 型 56.32%、T/T 型 8.25%，C 等位基因63.59%、T等位基因36.41%，发现MTHFR基因突变率似乎远不及上述研究的结果，可能与样本量小有关。本研究发现，3种基因型间性别、高血压、糖尿病、吸烟、饮酒人群构成比无显著差异。Yang等［14］亦发现，MTHFR基因突变与性别无显著相关性。C677T碱基突变，可使MTHFR的热敏感性改变而致酶活性改变。当MTHFR基因发生突变显著降低酶的活性，影响体内Hcy正常代谢，使之在体内堆积。据研究MTHFR基因C/T型酶活性为C/C型的65%，而T/T型酶活性仅为C/C型的30%，导致C/C型血浆Hcy水平较C/T型及T/T型明显升高［15］。Casas 等［16］通过荟萃分析证实，Hcy 与MTHFR基因677C/T多态性呈量效关系。Yadav等［3］荟萃分析发现，T/T基因型与HHcy的OR为2.26。我们研究发现，MTHFR基因与Hcy水平显著相关(P＜0.01)，C/C 突变较 C/T、T/T血浆 Hcy水平显著增高。此结果与Bharatkumar等［17］研究结果一致。也有少数研究显示，MTHFR(677C-T)纯合突变对Hcy血症影响不明显［18］。本研究还发现，轻度HHcy者基因分布与非HHcy者无显著差异，而轻度与中度HHcy基因分布有明显差异，即说明HHcy与MTHFR基因多态性相关;Hcy中度增高与基因突变关系更大。已有研究表明，C677T突变与轻中度HHcy有关，T/T型血清Hcy水平较C/C型高平均3.5 μmol/L 或高 40%［19］。而 Yilmaz 等［20］研究认为，HHcy明显增高与UA关系更大。由于本实验缺乏重度HHcy组，所以尚未验证。但是比较三组基因型间UA未发现显著差异，似乎纯合子的UA较突变组偏高，与来自日本［21］及韩国［22］的研究结论相反，原因尚不明确。T/T和C/T型的叶酸、维生素B12水平虽然低于C/C型，但是无统计学差异。有研究表明，叶酸不能减少细胞间Hcy浓度或者其相关物质，而是通过影响MTHFR活性而干扰SAM抑制酶发挥调节细胞间甲基代谢的作用［23］。所以，叶酸、维生素B12与MTHFR基因突变是否相关尚需进一步研究。

总之，本研究发现ACI患者MTHFR基因多态性与Hcy显著相关，Hcy中度增高与该基因突变关系更大。虽然3种基因型叶酸及维生素B12无显著差异，但有研究证实MTHFR基因C/T、T/T型Hcy在叶酸强化前后都高于C/C型［24］。因此，可根据MTHFR基因型等因素补充不同剂量的叶酸，为我国H型高血压(伴有HHcy的原发性高血压［25］)乃至脑血管疾病的预防和治疗提供客观依据。MTHFR基因与UA的关系尚需进一步探讨。本研究存在持续时间短、样本小、代表性不足等局限性，需扩大样本进一步研究。

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