腺相关病毒及慢病毒载体对骨髓间充质干细胞基因转染效率的比较

苏玉金，赵育梅，顾漪

·基础研究·

腺相关病毒及慢病毒载体对骨髓间充质干细胞基因转染效率的比较

苏玉金，赵育梅，顾漪

目的比较腺相关病毒(AAV)载体和慢病毒(LV)载体在间充质干细胞(MSCs)基因转染中的效率。方法密度梯度离心法分离培养MSCs，HE染色、Nestin免疫荧光染色鉴定，BrdU标记观察增殖情况。分别包装AAV与LV假病毒颗粒，并感染MSCs，通过β-gal染色和绿色荧光蛋白检测，分别计算两者的转染效率。结果MSCs成功从骨髓分离。AAV载体介导的基因转染率为49.1%，LV载体的转染率为91.4%(P＜0.01)。结论LV载体介导的基因转染方法转染效率更高。

基因转染；腺相关病毒载体；慢病毒载体；骨髓间充质干细胞

[本文著录格式]苏玉金，赵育梅，顾漪.腺相关病毒及慢病毒载体对骨髓间充质干细胞基因转染效率的比较[J].中国康复理论与实践,2014,20(12):1117-1121.

骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是造血微环境的重要组成成分，可以分泌多种与造血有关的正负调控因子，发挥调控造血的作用。本世纪初发现BMSCs具有干细胞的特征，且具有多向分化的潜能，属于多能干细胞[1]。在体外特定培养条件下，BMSCs可以分化为成骨细胞[2]、软骨细胞、脂肪细胞[3]以及成肌细胞等间充质细胞，因此人们亦将之称为间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)[4]；近年来发现，MSCs还可以分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞与神经元[5-6]。由于具有多向分化潜能，而且可以自体取材、自体移植，无免疫排斥反应，所以BMSCs细胞是基因治疗潜在的理想工具，在细胞与基因治疗中有着广阔的应用前景[7]。

基因疗法有多种形式，可以将基因直接引入体内，也可以通过运载细胞携带治疗基因，通过细胞移植来治疗疾病。运载细胞携带目的基因的疗法，限制其应用的关键瓶颈在于基因的转染效率。本文比较腺相关病毒(adeno-associated viral,AAV)与慢病毒(lentiviral,LV)介导的基因转染效率。

1 材料与方法

1.1 细胞系

携带pAAV-helpe和pAAV-RC的人胚肾细胞HEK293(ATCC,Catalog#CRL-1573)包装细胞系；用于检测AAV病毒滴度的人纤维肉瘤细胞HT1080(ATCC,Catalog#CCL-121)。

1.2 主要试剂

HEK293转染试剂CaCl2、Na2HPO4、HEPES和NaCl，3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)：SIGMA公司。β-Galactosidase：北京鼎国生物技术有限公司。羟基脲和丁酸钠：SIGMA-ALDRICH公司。小鼠抗人TH单克隆抗体、生物素化山羊抗鼠IgM与辣根酶标记链霉卵白素：北京中杉金桥生物技术有限公司。LV病毒液：上海吉盛制药有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 MSCs分离与培养

成年雄性SD大鼠断头处死，常规消毒四肢及胸部皮肤，迅速取出四肢骨及胸骨。以预冷的PBS(含青霉素1×105U/L、链霉素0.1 g/L)冲洗两遍，7号注射针头吸取无血清α-MEM冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞冲洗液。细胞冲洗液小心加于2倍体积的淋巴细胞分离液上，室温2500 r/min离心25min。用吸管吸取液面交界处云雾状液体，放入盛有PBS 5 ml的离心管中，充分混匀，室温800 r/mmin离心5min。弃上清液，管内沉淀用PBS冲洗1遍，以含有20%胎牛血清的α-MEM重新悬浮细胞，接种至50 ml塑料培养瓶，置5%CO2培养箱中37℃培养24 h，细胞贴壁后换液。

1.3.2 BrdU标记与检测

待细胞长至50%融合时，吸弃培养基，加入BrdU标记培养基，5%CO237℃培育60min。吸弃BrdU标记培养基，清洗缓冲液冲洗3遍。乙醇固定液-20℃固定20min，缓冲液冲洗3遍。加入抗小鼠的荧光抗体工作液，37℃培育30min。缓冲液冲洗3遍。透明封片，于荧光倒置显微镜下观察。激发光波长450～500 nm，发射光波长515～565 nm。

1.3.3 AAV介导的基因转染

磷酸钙法将pAAV-lacZ、pAAV-helper、pAAV-RC质粒转染进HEK293细胞。转染后2 d收获病毒。将转染后的细胞连同培养基一同转移入直径15 ml的圆锥形管中。在液氮和37℃水浴中反复冻融4次，室温10,000 g离心10min以去除细胞碎屑。将上清转移入新的无菌管中。利用获得的假病毒颗粒感染HT1080细胞并计算病毒滴度。

MSCs接种后24 h，弃掉培养基，换上述收获的病毒上清感染细胞。2 d后，4%多聚甲醛固定，β-gal染色。

1.3.4 LV介导的基因转染

MSCs接种后24 h，弃掉培养基，更换为由吉凯基因公司包装的慢病毒病毒上清(滴度为2×108/ml)。2 d后，直接在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达。

1.3.5 转染细胞BrdU标记与检测

待细胞长至80%融合时，吸弃培养基，加入BrdU标记培养基，5%CO237℃培育40min。吸弃BrdU标记培养基，PBS冲洗3遍。4%多聚甲醛-20℃固定20min。PBS冲洗3遍，加入抗小鼠荧光抗体工作液，37℃培育30min。PBS冲洗3遍后透明封片。荧光倒置显微镜下观察。激发光波长450～500 nm，发射光波长515～565 nm。

1.3.6 Nestin免疫化学染色

将BMSCs接种到盖玻片上，生长24 h后，取出盖玻片，放入PBS中冲洗1遍。4%多聚甲醛固定。10%山羊血清封闭30min，加入小鼠抗大鼠Nestin单克隆抗体(对照组不加抗体，以PBST代替)，浓度1∶2000，4℃过夜。次日晨弃一抗，PBST冲洗3遍，入二抗(1∶500)，室温孵育2 h。弃二抗，PBST冲洗3遍，入三抗(1∶200)，室温孵育1 h。DAB显色。透明封片，倒置显微镜下观察照相。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 MSCs的鉴定

通过密度梯度离心法分离获得的细胞呈贴壁生长，形态不均一，以梭形为主，少部分呈多边形等不规则形状(图1A)。HE染色显示，细胞胞核较大，核仁1～3个，核浆比例大(图1B)。BrdU标记可见绝大多数的细胞均被标记(图1C、图1D)。少部分细胞Nestin染色阳性(图1E、图2F)。

2.2 AAV介导的基因转染效率

2.2.1 AAV假病毒颗粒的包装

通过磷酸钙法将AAV病毒载体及其辅助质粒导入HEK293细胞。转染后48 h,可见细胞培养液明显变黄，细胞接近100%融合。β-gal染色后，光学显微镜下可见大量细胞蓝染，部分蓝染细胞呈小圆球形；高倍镜下可见阳性细胞的胞浆和胞核均蓝染，无明显差异(图2A)。

2.2.2 AAV病毒滴度检测

将AAV-LacZ病毒包装液按1∶10稀释后感染HT 1080细胞，在10-9稀释梯度仍可以见到经呈蓝染的LacZ阳性细胞(图2B)。经计算，所获得的AAV病毒滴度为107/ml。

2.2.3 AAV假病毒颗粒感染MSCs的情况

光镜下可见大多数MSCs细胞呈现蓝染(图2C)。经计算，感染率为(49.1±6.5)%。

2.3 LV介导的MSCs基因转染效率

荧光显微镜下观察，可见绝大多数细胞均表达GFP(图3)。经计算，感染率为(91.4±7.6)%。与AAV相比，LV的感染率更高(n=3,P=0.002)。

图1 间充质细胞的生物学特性鉴定(200×)

图2 AAV介导的基因转染

图3 LV介导的基因转染MSCs(200×)

3 讨论

目前有很多疾病，如帕金森病、亨廷顿病等病因不明，缺乏有效的治疗手段。近年来兴起的细胞移植与基因疗法成为未来治愈这些疾病最有希望的治疗方法。但细胞与基因治疗中存在着两个十分关键的问题[8-10]：①运载细胞与宿主之间存在免疫排斥反应；②基因转染效率低。

MSCs可以自体取材，易于体外扩增，基因工程改造后可以自体回输，不存在免疫排斥。这对将来应用于临床具有重要意义。我们的研究显示，MSCs易于接受由AAV或LV介导的外源基因导入，LV介导的基因感染效率达91.4%。表明MSCs易于整合外源基因，是疾病基因治疗中非常理想的运载细胞。

基因转染的方法有脂质体转染法、氯化钙转染法、电穿孔法以及逆转录病毒介导法、腺病毒介导、腺相关病毒介导等，各有利弊。逆转录病毒载体和腺病毒载体最为常用。逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞，容纳外源基因的DNA片段长度不超过8 kb。腺病毒载体感染细胞时，病毒DNA游离在细胞核内，并不整合到染色体上，在体内不能实现稳定的长期表达，反复应用易引起免疫反应[11]。

AAV是一种复制缺陷型病毒，传统上需要辅助腺病毒或疱疹病毒共转染[12-13]。本研究采用AAV helper-free系统，该系统以pHelper质粒与HEK293细胞提供的基因产物替代腺病毒，以pAAV-RC提供rep与cap基因(两者分别编码病毒的复制信号与壳蛋白)，pAAV-MCS携带反向末端重复序列(Inverted terminal repeats,ITRs)。我们将目的基因LacZ构建在质粒pAAV-MCS上，将重组pAAV-LacZ、pHelper和pAAV-RC质粒一次共转染包装细胞，生产具有感染能力的AAV病毒颗粒。由于载体和辅助序列之间缺乏同源性，因此通过这种方式生产的AAV病毒不含野生型AAV病毒的污染。并且重组AAV病毒可以整合到19号染色体中，能够长期表达目的基因。我们的研究结果显示，磷酸钙沉淀法对于HEK293细胞的转染效果较好，由此包装产生的病毒颗粒无需浓缩，病毒滴度即可达到107/ml。重组病毒颗粒再次感染MSCs的效率也较高，可转染约一半的细胞。

人类免疫缺陷病毒21(HIV21)来源的LV载体越来越受到人们的重视。研究发现，LV载体最大的特点是可以感染非分裂期细胞。目前已成功应用LV载体感染了神经细胞、肝细胞、造血干细胞、胰岛细胞、肌肉细胞、视网膜色素上皮细胞、气道上皮细胞等。此外，LV载体容纳外源性目的基因的片段大，可以在体内较长期表达，免疫反应小，安全性较好[14-16]。我们的实验结果显示，LV载体携带的GFP基因可在MSCs细胞内高效表达，感染效率达91%。而且因为有Marker蛋白GFP的指示，非常便于观察目的基因的表达情况。

综上，AAV是基因治疗中一种安全有效的基因转染方法，尤其适合于长期基因表达。而LV更适合于目的片段比较大的基因，尤其适合于感染非分裂细胞如神经元。

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Efficiency of Gene Transfection with Adeno-associated Viral Vector or Lentiviral Vector in Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells

SU Yu-jin,ZHAO Yu-mei,GU Yi.Beijing Neurosurgical Institute,Tiantan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050,China

ObjectiveTo compare 2 kinds of commonly used viral vectors,adeno-associated viral(AAV)vector and lentiviral(LV)vector in the gene transfection for bone marrow derived mesenchymal stem cells(MSCs).MethodsMSCs were isolated with density gradient (lymphocytes seperation)and identified with HE staining and immunocytochemistory staining for Nestin.The proliferation of BMSCs was detected with BrdU labeling.AAV mediated gene transfection was carried out through recombinant AAV-LacZ viral particles.For LV mediated gene transfection,the LV particles were used directly.The transfection efficiency was estimated with β-gal staining and green fluorescent protein under the fluorescent microscope respectively.ResultsMSCs was successfully isolated from the bone marrow.HE staining showed that MSCs was with big nucleus,1-3 nucleoli,and high nucleocytoplasmic ratio.BrdU labeling suggested that MSCs were proliferating.Some MSCs expressed Nestin.The gene transfection efficiency mediated with AAV vector was 49.1%,and it was 91.4%with LV vector(P＜0.01).ConclusionThe LV vector is more efficient on gene transfection thanAAV vector.

gene transfection;adeno-associated viral vector;lentiviral vector;mesenchymal stem cells

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.12.005

R394.8

A

1006-9771(2014)12-1117-05

2013-12-10

2014-01-21)

国家重大新药创制科技重大专项资助项目(No.2012ZX09401004)。

北京市神经外科研究所，首都医科大学附属北京天坛医院，北京市100050。作者简介：苏玉金(1978-)，男，汉族，北京市人，主管技师，主要研究方向：神经病理学。通讯作者：顾漪(1981-)，女，汉族，江苏常州市人，硕士，助理研究员，主要研究方向：神经药理学。E-mail:yjs403@126.com。