ELISA法检测浓缩脑脊液ESAT-6对结核性脑膜炎的诊断价值

2014-05-08张昆南文安杨赟柴文胡凡胡国柱吴梨华吴晓牧

中国神经免疫学和神经病学杂志 2014年5期

张昆南文安杨赟柴文胡凡胡国柱吴梨华吴晓牧

张昆南文安杨赟柴文胡凡胡国柱吴梨华吴晓牧

目的探讨酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测浓缩脑脊液结核分枝杆菌早期分泌性抗原6000(6000 early secretory antigenic target,ESAT-6)对结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)的诊断价值。方法采用腰椎穿刺抽取106份脑脊液,其中49份来自TBM患者,57份来自非TBM患者。应用Amicon Ultra-4超滤离心管离心浓缩脑脊液。采用ELISA法检测脑脊液中ESAT-6含量。结果浓缩脑脊液ESAT-6抗原检出敏感性显著高于脑脊液原液的检出率(87.50%比67.35%,＜0.05),而其特异性与脑脊液原液比较无统计学差异(92.16%比96.49%,＞0.05)。结论应用离心超滤技术浓缩脑脊液能显著提高ELISA法检测脑脊液ESAT-6抗原的检出率,提高TBM的诊断率。

结核性脑膜炎；酶联免疫吸附试验；ESAT-6；诊断

结核性脑膜炎(TBM)是一种由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的高死亡率和高致残率的中枢神经系统感染性疾病［1］,临床表现和脑脊液改变常不典型,误诊率极高［2］。TBM患者脑脊液中MTB数量少,脑脊液涂片抗酸染色阳性率低,MTB培养耗时长［1,3-4］,故难为临床早期诊断提供帮助。如何早期、快速、准确诊断TBM,仍是世界性难题。本研究采用超滤离心浓缩脑脊液以增加TBM特异性早期分泌性抗原6000(6000 early secretory antigenic target, ESAT-6)的浓度,进而提高常规间接ELISA法对ESAT-6抗原的检出率,建立TBM的临床早期、快速、方便的诊断方法。

1 对象和方法

1.1 研究对象 106份脑脊液样本来源于2012-09-2014-01江西省人民医院和江西省胸科医院神经内科住院的患者。(1)TBM组共49例,按照Marais等［5］TBM诊断标准确诊,其中确诊TBM 10例,男5例,女5例,平均年龄(36.10±14.79)岁(15～60岁)；临床诊断TBM 39例,男19例,女20例,平均年龄(39.26±16.43)岁(3.5～67岁)。(2)非TBM患者57例作为对照组,男37例,女20例,平均年龄(38.20±15.71)岁(17～75岁),其中病毒性脑膜炎19例,化脓性脑膜炎10例,新型隐球菌性脑膜炎7例,多发性硬化4例,蛛网膜下腔出血4例,脑梗死3例,神经梅毒2例,脑囊虫病2例,周围神经病2例,亚急性联合变性2例,吉兰-巴雷综合征2例。

1.2 方法

1.2.1 脑脊液样本采集和浓缩：将常规腰穿抽取的脑脊液3 m L加入超滤离心管,4°C 2500离心(Allegra 6R,美国Beckman-Coulter公司)40 min,浓缩至50～100μL。

1.2.2 建立标准曲线：利用棋盘滴定法确定抗原、抗体最适工作浓度。碳酸盐包被缓冲液(p H9.6)梯度稀释ESAT-6抗原(0.5 mg/m L,英国Abcam公司)并包被于96孔板中(每个浓度设3个复孔),一抗为鼠抗ESAT-6单抗(1 mg/m L,英国Abcam公司),采用间接ELISA法检测不同浓度标准品的吸光度﹝(λ)﹞值,以浓度为横坐标,以(λ)为纵坐标,建立标准曲线。

1.2.3 脑脊液ESAT-6检测：96孔酶标板(广州洁特生物过滤制品有限公司)设置标准品孔、待测脑脊液孔、阴性对照孔、空白孔。其中标准品孔设ESAT-6抗原200、150、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 ng/m L等9个浓度梯度,每孔50 μL；待测脑脊液原液、脑脊液浓缩液各50μL加于待测样品孔内,阴性对照孔内加入50μL健康人脑脊液,封板后置4°C冰箱孵育过夜；然后弃去脑脊液,PBST洗涤2次(100μL/孔),加3%(质量浓度)牛血清白蛋白-PBS置37°C封闭1 h,再以PBST洗涤5次(200μL/孔)；每孔加100μL鼠抗ESAT-6单抗(1∶3200稀释度),阴性对照孔内加等量无关鼠源Ig G抗体,37°C孵育2 h,然后PBST洗涤5次；每孔加入100μL的羊抗鼠Ig GHRP二抗(1 mg/mL,北京全式金生物技术有限公司,1∶5000稀释度),37°C孵育1 h；弃液后用PBST洗涤5次,每孔加100μL TMB显色液(江苏碧云天生物技术研究所),避光10～15 min,再加100μL 2 mol/L H2SO4终止液,采用酶标仪(美国Thermo electron公司)测定450 nm波长下各孔的(λ)值,以空白孔调零。利用标准曲线计算相应脑脊液样本中ESAT-6的水平。

1.3 统计学处理采用SPSS17.0统计软件对数据进行分析,非正态分布的计量资料以中位数和四分位数间距表示,采用Wilcoxon秩和检验；计数资料以率表示,采用χ2检验或校正χ2检验公式计算。以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑脊液原液ESAT-6水平测定根据阴性对照组ESAT-6的所测含量,确定ESAT-6阳性临界值(cut off)为1.5625 ng/m L。脑脊液原液检测出ESAT-6的敏感性为67.35%,特异性达96.49%。TBM组、确诊TBM组和临床诊断TBM组其阳性率均较非TBM对照组高(χ2=48.552,=0.000；χ2=40.289,=0.000；χ2=39.486,=0.000),其ESAT-6含量亦均较非TBM对照组高(= -9.168,=0.000；=-6.559；=0.000；= -8.727；=0.000)(表1)。

表1 各组脑脊液原液中ESAT-6水平表达情况

2.2 超滤离心浓缩脑脊液ESAT-6水平测定对脑脊液达到3 m L的91例患者进行脑脊液超滤离心浓缩。浓缩脑脊液检测出ESAT-6的敏感性为87.50%,特异性为92.16%。与对照组比较,TBM组、确诊TBM组和临床诊断TBM组其阳性率均较非TBM对照组高(χ2=58.083,=0.000；χ2= 30.784,=0.000；χ2=49.217,=0.000),其ESAT-6平均含量均较非TBM对照组高(= -7.873,=0.000；=-5.878,=0.000；= -7.581,=0.000),且确诊TBM组其ESAT-6平均含量较临床诊断TBM组高(=-2.435,=0.015)(表2)。

浓缩脑脊液检出ESAT-6的敏感性高于脑脊液原液(χ2=4.961,=0.026),而特异性两者间无统计学差异(χ2=0.964,=0.326)。

表2 各组脑脊液浓缩液中ESAT-6的表达情况

2.3 发病后不同时期内脑脊液ESAT-6检测

2.3.1 脑脊液原液ESAT-6检测：TBM组发病时间在1 d～5个月,其中≤14 d者16例(10例已行抗结核治疗),14～30 d者23例(全部行抗结核治疗),＞30 d者10例(全部行抗结核治疗)。非TBM对照组发病时间在1 d～2年,其中≤14 d者31例,14～30 d者14例,＞30 d者12例。各组发病后不同时间段内ESAT-6检测的敏感性或特异性结果见表3。

表3 发病后不同时期内脑脊液原液ESAT-6检测结果

2.3.2 脑脊液浓缩液ESAT-6检测：TBM组发病时间≤14 d者13例(9例已行抗结核治疗),14～30 d者19例(全部行抗结核治疗),＞30 d者8例(全部行抗结核治疗)。非TBM组发病时间≤14 d者30例,14～30 d者11例,＞30 d者10例。各组发病后不同时间段内ESAT-6检测的敏感性或特异性结果见表4。

3 讨论

ESAT-6是MTB感染早期所分泌的一种低分子量抗原［6］,其只存在于致病性MTB中,而卡介苗中则无,故其是很好的MTB早期感染的诊断标志物［7］。Kashyap等［8］利用ELISA法检测TBM患者脑脊液中ESAT-6抗原获得了80%的敏感性和94%的特异性。Song等［9］研究显示其检测敏感性和特异性分别为88%、92%。该研究通过ELISA法检测绘制的标准曲线,确定了脑脊液中ESAT-6最低检测浓度为1.5625 ng/m L(临界值),结果显示脑脊液原液ESAT-6的阳性率为67.35%,特异性达96.49%,敏感性低于Kashyap等和Song等的报道。其原因可能是Kashyap等和Song等研究所检测样本分别是未经抗结核治疗和发病2周以内的患者脑脊液原液,此时患者脑脊液中MTB数量多、ESAT-6含量相对较高。该研究通过检测2周内(10例已行抗结核治疗)的确诊TBM患者脑脊液原液其阳性率100%,临床诊断TBM其阳性率81.8%(两者合并的敏感性达87.5%),特异性达93.5%,其阳性率与Song等的报道结果一致。但需注意的是,本组病例绝大多数经过治疗,因此推测其敏感性较Song等研究结果要高一些。此外,本研究结果显示,发病15～30 d其确诊TBM患者脑脊液原液阳性率达100%,临床诊断TBM其阳性率达68.4%(两者合并的敏感性达73.9%),特异性达100%；甚至＞30 d时其临床诊断TBM患者敏感性和特异性也达到20%和100%。

表4 发病后不同时期内脑脊液浓缩液ESAT-6检测结果

截留分子量为3000的超滤离心管能有效地浓缩脑脊液中的ESAT-6(相对分子量为9975［10］)抗原,可提高其含量。本研究显示浓缩脑脊液检测2周以内的确诊TBM患者阳性率达100%,临床诊断TBM的患者达87.5%(两者合并的敏感性达92.3%),且特异性达86.7%；对于发病14～30 d的确诊TBM 患者浓缩脑脊液敏感性也高达100%,临床诊断TBM的患者达88.2%,特异性也高达100%；而对于发病＞30 d的确诊TBM和临床诊断TBM的患者敏感性也达100%和71.4% (两者合并的敏感性达75.0%),特异性为100%。由此可见,超滤离心能有效地浓缩脑脊液中ESAT-6抗原,提高ESAT-6的检出率及TBM诊断率。本组中有1例确诊TBM患者脑脊液原液ESAT-6检测阴性经超滤离心浓缩后ESAT-6检测则为阳性,该例患者入院时脑脊液改良抗酸染色为阳性,抽取脑脊液时已经给予抗结核药物治疗42 d,所以MTB含量很低,且脑脊液常规、生化、细胞学等检查已基本趋于正常。临床诊断TBM组患者脑脊液原液ESAT-6检测有15例为阴性,而经过脑脊液浓缩之后10例检测为阳性。非TBM对照组中2例脑脊液原液和4例浓缩液出现阳性(其中2例脑脊液原液和浓缩液均阳性),这可能是由临床误诊或患者合并MTB感染所致：例如2例患者中1例为病毒性脑膜炎患者,其合并2型糖尿病和类风湿性关节炎,长期服用硫酸羟氯喹、甲氨蝶呤及醋酸泼尼松治疗；另1例为隐球菌性脑膜炎,合并新型隐球菌性败血症和肺部感染,皮肤PPD试验阳性；另外,ESAT-6可能是与其他病原存在交叉反应。

综上所述,本研究结果显示利用超滤离心浓缩脑脊液中ESAT-6抗原可快速和显著提高TBM的诊断率,尤其适合经治疗的TBM患者的诊断,值得推广应用。

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WU Xiao-mu,Email：wuxm79@163.com

Objective To explore the diagnostic value of detecting concentrated cerebrospinal fluid 6000 early secretory antigenic target(ESAT-6)by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)on tuberculous meningitis(TBM).Methods One hundred and six copies of cerebrospinal fluid were collected using lumbar puncture.Among them 49 copies were from the TBM patients and 57 copies from the non-TBM patients.The cerebrospinal fluid were concentrated using Amicon Ultra-4 ultrafiltration centrifugation.The ESAT-6 antigen in cerebrospinal fluid was detected using ELISA assay.Results The detection sensitivity of ESAT-6 antigen in concentrated cerebrospinal fluid was significantly higher than that in primary cerebrospinal fluid(87.50% compared to 67.35%,＜0.05),and there was no statistical difference between the detection specificity of ESAT-6 antigen in concentrated cerebrospinal fluid and primary cerebrospinal fluid(92.16%compared to 96.49%,＞0.05).Conclusions The detection rate of ESAT-6 antigen can be markedly increased using centrifugal ultrafiltration technology to concentrate cerebrospinal fluid,and the diagnosis rates of tuberculous meningitis can be improved.

tubercular meningitis；enzyme-linked immunoabsorbent assay；ESAT-6；diagnosis

R529.3

：A

：1006-2963(2014)05-0360-04