鸡油菌中总黄酮含量的测定及抗氧化活性研究

郭豫梅

（陕西理工学院化工学院，陕西汉中723001）

鸡油菌别名黄丝菌、杏菌，是一种外生菌根真菌，属真菌界、担子菌门、同担子菌纲、鸡油菌目、鸡油菌科和鸡油菌属[1]。其实体肉质，全菌杏黄色、蛋黄色或枇杷黄色，有浓郁的杏仁果香味，微甜，肉质内实。多见于夏秋季，常生于排水良好的缓坡上的针阔叶林地上，如松树下腐烂的松毛下面或麻栎下的草丛里，群生或近丛生。在我国主要分布于贵州、云南、黑龙江、江苏、青海、四川、西藏等地[2]。研究表明，该菌性平，味甘，有清目利肺、益肠胃之功效，经常食用可治疗VA缺乏所引气的皮肤粗糙或干燥症、夜盲症、视力失常、眼炎等疾病以及预防某些呼吸道感染的疾病。据报道，该菌试验有抗癌作用，对小白鼠肉瘤180抑制率为60%，对艾氏癌的抑制为70%，另有抑制和抗某些细菌的作用[3]。

经实验表明，黄酮类化合物对心血管、脑血管、肿瘤等方面均有显著的药理作用，说明此类化合物确有多种生物活性[4]。该类化合物种类繁多，存在植物体中含有多重药理作用，如黄蜀葵花总黄酮可以保护心肌受损、抗心绞痛、保护缺血性脑损伤；银杏黄酮则具有镇痛、降血压、抗凝血、保护脑血管等作用。故其作为新药研究开发的先导化合物，是一个值得重视的资源，具有重要的现实应用意义[5-6]。但有关鸡油菌黄酮类化合物抗氧化活性方面的研究还未见报导，本文采用醇浸提取鸡油菌中总黄酮类化合物，并主要研究其抗氧化活性。所得结果可为鸡油菌在食品、医药等领域的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 材料

鸡油菌：购于陕西汉中。

1.1.2 试剂

芦丁：中国药品生物制品检定所，纯度≥99%；乙醇、亚硝酸钠溶液、氢氧化钠、硝酸铝溶液、邻苯三酚、抗坏血酸（VC）、邻二氮菲、对氨基苯磺酸溶液、盐酸萘已二胺溶液均为分析纯。

1.1.3 仪器

GR-200电子分析天平：日本AND；722型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；101型电热鼓风干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司。

1.2 方法

取鸡油菌样品在干燥箱中70℃干燥，粉碎，过100目筛。用天平精确称取15.000 0 g的样品，放入烧杯中，加入200 mL 85%的乙醇溶液，在70℃下浸提20 h。抽滤，得总黄酮提取液[7]。

1.2.1 标准曲线的绘制

精确称取芦丁样品5.000 0 mg，置50 mL容量瓶中,用30%乙醇适量置水浴上加热溶解，放冷，再用30%乙醇稀释至刻度,摇匀。量取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 分别置于10 mL容量瓶中，各加30%乙醇至5.0 mL，然后加5%亚硝酸钠溶液1.0 mL摇匀，放置6 min，10%硝酸铝溶液1.0 mL摇匀，放置6 min，再加4%氢氧化钠溶液10.0 mL，用30%乙醇稀释至25 mL，放置15 min后，置比色皿中，以试剂同法操作作为空白，在波长510 nm处测定吸光度。以吸光度（A）为横坐标，浓度（C）为纵坐标，绘制标准曲线（见图1），得到回归方程为：C=0.091 2A+0.026 3（R=0.999 7）。

图1 芦丁的标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

1.2.2 含量的测定

分别精确量取待测液0.1 mL，加入9.9 mL的30%乙醇，置于25mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1.0mL摇匀，放置6 min，10%硝酸铝溶液1.0 mL摇匀，放置6 min，再加4%氢氧化钠溶液10.0 mL，用30%乙醇稀释至25 mL，放置15 min后，置比色皿中，以试剂同法操作作为空白，在波长510 nm处测定吸光度。通过回归方程计算出溶液浓度（C）（单位g/L）。再运用计算公式：T=C（g/mL）×10×N×50 mL/5 000 mg。得到样品中总黄酮百分含量（T）[8]。

1.2.3 抗氧化性的测定

1.2.3.1 鸡油菌黄酮类化合物对超氧自由基（O2·-）的清除作用

采用邻苯三酚自氧化法[9]。取0.05 mol/L，pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5 mL加入盛有4.2 mL蒸馏水的试管中，置25℃水浴中预热20 min。分别加入不同的试样醇提物溶液0.1 mL，立即加入在25℃水浴中预热的3 mmol/L邻苯三酚（由10 mmol/L HCl配制）0.3 mL，混匀后25℃水浴中准确反应4 min，立即加入8 mol/L HCl 2滴终止反应，在420 nm处测定吸光度（样品管以同浓度的试样醇提物溶液做参比）。模型组以0.1 mL蒸馏水代替样品试液（以蒸馏水做参比）。用抗坏血酸（VC）做对照，分别测定五组不同浓度的的样品液及抗坏血酸的吸光度。临用前以浓度为50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）配置。超氧自由基（O2·-）按以下公式计算清除率。

1.2.3.2 鸡油菌黄酮类化合物对羟基自由基（·OH）的清除作用

用邻二氮菲-Fe2+氧化法测定Fe2+/H2O2体系中产生的·OH自由基[10]。依次加入邻二氮菲1.5 mL，pH7.4的PBS溶液3.8 mL及试样总黄酮溶液1 mL（损伤管及未损伤管不加试样总黄酮溶液）混匀，再加FeSO4溶液1.5 mL，立即混匀，最后加H2O21 mL（未损伤管不加）。最终浓度邻二氮菲0.75mmol/L、FeSO40.75mmol/L、H2O20.01%,总体积9 mL（不足用蒸馏水补足）。各管置37℃恒温水浴箱保温60 min，分别测定各管A536值（样品管以同浓度的试样总黄酮溶液做参比，损伤管及未损伤管以蒸馏水做参比）。用抗坏血酸（VC）做对照，分别测定五组不同浓度的样品液及抗坏血酸的吸光度。临用前以蒸馏水配置。（·OH）自由基按以下公式计算清除率。

1.2.3.3 鸡油菌黄酮类化合物对亚硝酸盐清除率的测定

取已知浓度的提取液2 mL于25 mL容量瓶，加入5 μg/mL的NaNO2标准溶液3 mL，加入柠檬酸－磷酸缓冲溶液（pH＝3.0）5 mL，37℃下反应 15 min，立即加入2 mL 0.4%对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3 min～5 min后，加入1 mL 0.2%盐酸萘已二胺溶液，加蒸馏水至刻度，混匀，静置15 min，以5 mL提取液为空白，在540 nm处测吸光度。用用抗坏血酸（VC）做对照，分别测定五组不同浓度的的样品液及抗坏血酸的吸光度[11-12]。按下式计算NO2－的清除率。

式中：A0为NO2－的溶液吸光度；A为样品组的吸光度。

2 实验结果

2.1 总黄酮含量的测定

根据1.2.2可得出鸡油菌中总黄酮含量为0.68%，从而可得提取液中黄酮含量为0.204 1 g/L。

2.2 抗氧化性的研究

2.2.1 对超氧自由基（O2·-）的清除作用

根据方法1.2.3.1，配制五种不同浓度的样品溶液，测定其吸光度，并计算其对O2·-的清除率，以抗坏血酸为对照，同法测定其吸光度，并计算其对O2·-的清除率，见图2和图3。

2.2.2 对羟基自由基（·OH）的清除作用

图2 总黄酮对超氧自由基的清除率Fig.2 O2-·radical scavenging rate of total flavonoids

图3 抗坏血酸对超氧自由基的清除率Fig.3 O2·-radical scavenging rate of VC

根据方法1.2.3.2，配制5种不同浓度的样品溶液，测定其吸光度，并计算其对·OH的清除率，以抗坏血酸为对照，同法测定其吸光度，并计算其对·OH的清除率，见图4和图5。

图4 总黄酮对羟自由基的清除率Fig.4 ·OH radical scavenging rate of total flavonoids

2.2.3 对亚硝酸盐（NO2-）清除率的测定

根据方法1.2.3.3，配制5种不同浓度的样品溶液，测定其吸光度，并计算其对NO2-的清除率，以抗坏血酸为对照，同法测定其吸光度，并计算其对NO2-的清除率，见图6和图7。

由以上各图可得当总黄酮浓度为0.204 1 mg/mL时，对超氧阴离子的清除率为44.2%，羟基自由基的清除率为11.4%，亚硝酸根的清除率为50%。

图5 抗坏血酸对羟自由基的清除率Fig.5 ·OH radical scavenging rate of VC

图6 总黄酮对亚硝酸盐的清除率Fig.6 NO2-scavenging rate of total flavonoids

图7 抗坏血酸对亚硝酸盐的清除率Fig.7 NO2-scavenging rate of VC

3 结论

由实验可得当总黄酮浓度为0.204 1 g/L时，对超氧阴离子的清除率为44.2%，羟基自由基的清除率为11.4%，亚硝酸根的清除率为50%。鸡油菌总黄酮能有效的清除超氧自由基（O2·-）、羟基自由基（·OH）及亚硝酸盐（NO2-）。其质量浓度与对超氧自由基（O2·-）、羟基自由基（·OH）及亚硝酸盐（NO2-）的清除作用成正相关系，虽然其清除率小于VC对超氧自由基、羟基自由基（·OH）及亚硝酸盐（NO2-）的清除作用但通过对鸡油菌黄酮清除自由基能力的测定，确定其具有较强的清除超氧自由基（O2·-）、羟基自由基（·OH）及亚硝酸盐（NO2-）的能力，从而确定了鸡油菌黄酮具有抗氧化能力，可将其作为抗氧化剂应用到食品和药品行业中，这也将为进一步的促进天然抗氧化剂的研究与开发起到一定的积极作用。

[1] 廖显辉,杨燕红.食用菌类保健食品的开发探讨[J].农业科技,2008,11(7):241-242

[2] 上官周建,吴鹤群.食用菌抗氧化物的活性与应用研究[J].中国食用菌,1999(3):12-13

[3] 殷蔚申.食品微生物学[M].北京:中国财政经济出版社,1991:241-249

[4] 李张伟,刘宇辉,张珠珠.橄榄黄酮的提取及其抗氧化作用的研究[J].广东化工,2007,34(12):37-40

[5] 陈季武,胡天喜,朱振勤.银杏叶黄酮抗氧化作用的研究[J].华东师范大学学报:自然科学版,1998,3(1):88-90

[6] 张海生,陈锦屏.蜂蛹黄酮的提取及体外抗氧化作用的研究[J].食品科学,2008(2):158-162

[7] 项昭保,任绍光,石轶松,等.吸光光度计法测定荞麦秸中总黄酮含量[J].理化检验—化学分册,2002,38(9):436-437

[8] 叶菊,苏印泉,吕建荣,等.罗布麻总黄酮含量的研究[J].西北林学院学报,2006,21(3):114-115

[9] 张晓强,浦跃朴,尹立红,等.冬虫夏草及人工虫草菌丝体对超氧阴离子自由基和羟自由基清除作用的实验研究[J].中国老年学杂志,2003,23(11):773-775

[10]金鸣,蔡亚欣,李金荣,等.邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由基[J].生物化学与生物物理进展,1996,23(6):553-555

[11]沈莞梅,靳学远.石榴叶总黄酮抗氧化性的研究[J].安徽农学通报,2008,14(21):63-64

[12]薛长晖,王佩维,姚晨之.苦荞粉提取液对NO2-清除作用的体外试验研究[J].粮油加工与食品机械,2002(10):48