致泻性大肠杆菌基因芯片检测方法的建立

王乃福，吴冬雪，张霞，刘培，张海英，高旗利

（天津出入境检验检疫局，天津300456）

致泻性大肠杆菌（DEC）是细菌性腹泻的常见病原菌，它包括肠致病性大肠杆菌（EPEC）、产肠毒素大肠杆菌（ETEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）和肠聚集性大肠杆菌（EAEC）。据世界卫生组织统计，全世界每年有10亿人患腹泻，其中5亿人发生在第三世界，导致每年5百万婴幼儿死亡，虽然不同地区的自然环境和生产、生活方式有所差异，引起腹泻病的主要病原体有所不同，但致泻性大肠杆菌是近年来国内外十分关注的引起人类临床腹泻和食物中毒的重要病原菌，由致泻性大肠杆菌引起的腹泻病例数始终位于第二位，可见大肠杆菌肠道传染的广泛性[1]。大肠杆菌O157是近年来新发现的危害严重的肠出血性大肠杆菌血清型，同其他血清型致泻性大肠埃希氏菌相比，O157血清型致病性更强，最低致病剂量更低，患者发病后病死率较高。自1982年美国首次发现该血清型以来，在世界上很多国家相继发生了爆发和流行，现已成为全球性的公共卫生问题之一。目前，我国致泻性大肠杆菌的检测仍以血清型检测为主，但由于此方法假阳性率比较高，所需检验时间较长，已越来越不能满足快速发展的国际贸易、食品安全突发事件的需要，必须寻求一种高通量诊断方法一次鉴定多个致泻性大肠杆菌血清型。基因芯片技术是近年来兴起的一种基因诊断技术，该技术具有快速、敏感、高效、平行化、自动化等特点，既可以应用许多不同的探针来检测同一靶基因以降低假阳性率，还可以通过集成多种病原的基因探针来对病原体进行快速的诊断、鉴别诊断与基因分型[2]。自1995年被应用以来，已广泛应用于基因图谱绘制、基因表达分析、疾病诊断、药物筛选、疫苗研制、环境监测等多个领域[3-5]。本试验运用基因芯片技术，拟建立一种针对包括EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC 和 大 肠 埃 希 氏 菌O157血清型的诊断方法，以期进一步提高实验室诊断效率，为临床疾病诊断、食物中毒检测、进出口食品检疫、流行病学调查等工作提供有效检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及来源

肠致病性大肠杆菌（EPEC）、产肠毒素大肠杆菌（ETEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠聚集性大肠杆菌（EAEC）和大肠杆菌O157来自德国大肠杆菌国家实验室，沙门氏菌、变形杆菌、腊样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌来自中国医学微生物菌种保藏管理中心，非致泻型大肠杆菌为本实验室分离保存。

1.1.2 主要试剂及仪器

试剂：ExTaq DNA聚合酶：dNTPs购自大连宝生物工程有限公司，细菌培养基均购自北京陆桥技术有限责任公司，细菌基因组提取试剂盒购自QIAGEN公司。

仪器：恒温培养箱Binder，德国；PCR仪Biometra，德国；水浴箱Shellab，美国；杂交培养箱HybriLinker，美国；芯片点样仪PerkinElmer，美国；共聚焦激光扫描仪GenePix 4000B，美国。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计和探针的合成

根据Genbank中肠致病性大肠杆菌（EPEC）、产肠毒素大肠杆菌（ETEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠聚集性大肠杆菌（EAEC）和大肠杆菌O157的序列，通过序列比对，筛选出特异DNA序列。由于Genbank上这些菌株的序列资源较为丰富，分析这些特异序列之后进行目的基因的筛选，并根据目的基因设计相应的引物和探针，得到了针对各种菌株特异目的基因的PCR引物9对，探针23条。同时设计负对照探针Cy3-（T）40。使用工具Primer premier 5.0软件进行设计且所有引物和探针设计完成后，使用ClustalX 1.83进行基因序列特异性比对，以确保引物和探针之间的特异性。引物和探针均由上海生物芯片有限公司合成。

1.2.2 菌株的培养

大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、腊样芽孢杆菌用NA培养基37℃过夜培养，然后挑取3个～4个菌落接种到LB液体培养基，在培养箱经过37℃培养24 h。副溶血性弧菌用氯化钠蔗糖平板37℃培养24 h，然后挑取3个～4个菌落接种到氯化钠结晶紫增菌液，37℃增菌8 h～16 h。产气荚膜梭菌挑取适量的菌种接种到SPS培养基，37℃厌氧培养24 h～48 h，挑取黑色菌落于液体硫乙醇酸钠中增菌。金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌用TSA血平板37℃过夜培养，取3个～4个菌落接种到LB液体培养基，37℃培养24 h。

1.2.3 DNA的提取

细菌DNA的提取按照QIAGEN公司细菌基因组提取试剂盒使用说明中得操作规程进行提取。

1.2.4 多重PCR扩增

将肠致病性大肠杆菌（EPEC）、产肠毒素大肠杆菌（ETEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠聚集性大肠杆菌（EAEC）和大肠杆菌O157的多个目的基因分为两组进行多重PCR扩增。第一组为 Stap、Stah、wzy、ipaH、eae，第二组为 LT、stx1、stx2、aggR。反应体系为10×PCR缓冲液，2.5μL；dNTP，0.5μL；上游引物各0.2μL；下游引物各0.8μL；模板 DNA，5μL；Taq酶，0.3 μL；去离子水补足 25 μL。PCR 反应程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35 个循环；72℃ 5 min。

1.2.5 芯片的制备

将探针加入到384孔板中相应的位置，每孔加入10 μL探针。利用PerkiElmer公司的SpotArray微阵列点制系统基因芯片点样仪将384孔板中的探针点到玻片上，每条探针重复点样3次。点好的芯片在室温下过夜干燥，然后45℃烘箱干燥2 h。干燥后的芯片放回洁净的芯片盒中避光保存备用。点样阵列为7×4，每个芯片上共点8个阵列。芯片上探针排列见下图1。

1.2.6 基因芯片的杂交

将杂交液置65℃烘箱中预热15 min，混匀10 μL预热的杂交液、6 μL去离子水、第一组和第二组PCR混合液产物各2 μL混匀后98℃变性5 min，立即置于冰上5 min；取杂交仓，在底部凹槽内均匀的加入200 μL去离子水，将变性后的杂交混合液全部垂直加入盖片加样孔中，组装好杂交仓，放入60℃水浴锅中，杂交2 h。将杂交好的基因芯片取出，依次在洗液Ⅰ中轻柔提洗3 min，洗液Ⅱ中轻柔提洗3 min，95%乙醇中轻柔提洗90 s，使用吹风机快速吹干。

图1 芯片点阵示意图Fig.1 Schematic diagram of probe square of the chip

1.2.7 基因芯片的结果判定

芯片用GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪扫描，使用532 nm单色荧光、100%Power Gain、10μm分辨率，根据信号点的荧光强度调节光电倍增管（PMT）值至650，利用GenePixPro软件得到每个探针位点的荧光信号强度值，用cutoff值（SNR=3.5）去除信号低的探针，只有高于cutoff值的探针信号被视为有效信号。

1.2.8 基因芯片的特异性检测

用制备的基因芯片和上述杂交方法，对本研究检测的多种致泻性大肠杆菌和沙门氏菌、变形杆菌、腊样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌、非致泻型大肠杆菌等近缘菌株进行多重PCR扩增和芯片杂交检测，验证制备基因芯片的特异性。

1.2.9 基因芯片的灵敏度检测

采用“添加检出”的方式，将肠致病性大肠杆菌（EPEC）、产肠毒素大肠杆菌（ETEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠聚集性大肠杆菌（EAEC）和大肠杆菌O157纯菌培养液10倍梯度稀释（100cfu/mL～108cfu/mL），分别各取 10 mL 纯菌培养液提取基因组，用于进行多重PCR试验和芯片杂交检测。本研究选取大肠杆菌O157（882364株）wzy基因进行纯菌的灵敏度试验。

1.2.10 基因芯片检测方法的实际应用

采用建立的基因芯片检测方法，对从市场、超市等购买48份食品样品进行检测。

2 结果

2.1 多种致泻性大肠杆菌PCR扩增

对 EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC 及大肠杆菌O157进行扩增，均得到预期目的片段，表明针对各病原引物特异性良好。

2.2 杂交特异性试验

在多重PCR试验成功的基础上，使用所设计的每一条探针，对相应的菌株DNA进行检测，每个标准菌株DNA检测结果见图2。

图2 标准菌株芯片杂交结果Fig.2 Hhybridizated results of standard strains

从图2中可以看出，所设计的探针对相应的菌株检测均可以得到正确的检测结果。另外使用沙门氏菌、变形杆菌、腊样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌、非致泻型大肠杆菌等8株近缘菌株进行多重PCR扩增和芯片杂交检测，检测结果见图3。

图3 8株近缘菌株杂交结果Fig.3 Hybridizated results of eight closely related bacterial strains

从图3中可以看出，8株近缘菌芯片中均未出现所研究的 EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC 及大肠杆菌O157的目的基因的检测信号。

2.3 芯片灵敏度试验

选取大肠杆菌O157（882364株）wzy基因进行纯菌的灵敏度试验，检测结果见图4。

图4 大肠杆菌O157灵敏度试验Fig.4 Sensitivity test of Escherichia coli O157

由图4可知，芯片对大肠杆菌O157的检测灵敏度为104cfu/mL。本方法2次检测结果相同，表明该方法具有良好的可重复性。其它致泻性大肠杆菌的检测灵敏度结果见表1。

表1 各致泻性大肠杆菌纯菌灵敏度Table 1 The sensitivity of the diarrheagenic Escherichia coli bacteria respectively

2.4 实际样品的检测

从市场、超市等购买如下食品（见表2），并分别编号，采用我们建立的致泻性大肠杆菌的检测方法，进行检测。

表2 检测的实际样品Table 2 The samples detected

检测结果显示：第11号生猪肉样品检出毒力基因eae，第16号生猪肉样品检出毒力基因lt。全部实际样品经国标的血清学检测方法确认，两种方法检测结果完全一致。单纯48例实际样品检测结果而言，该方法检测的准确性为100%，假阳性和假阴性率均为0%。

3 讨论

多重PCR是在同一PCR体系中同时加入多种病原微生物的特异性引物进行PCR扩增。多重PCR与单重PCR相比，大大提高了效率，在同一PCR反应管内可同时检出多种病原微生物，节省了时间，减少了费用。基因芯片技术具有快速、准确、高通量、自动化等特点。运用基因芯片技术检测致病菌的同类研究已有报道。多重PCR与基因芯片技术的整合可以实现两种技术的优势互补，通过PCR的基因放大作用和芯片的荧光探针杂交技术使此种检测体系达到较高的灵敏度和特异度[6-7]。本研究综合了多重PCR和基因芯片技术的优势，采用多重PCR和基因芯片联用的技术，建立了高通量芯片检测方法，可以高效特异的检测多种致泻性大肠杆菌，纯菌检测灵敏度可达104cfu/mL，达到较高的检测灵敏度，这与其他文献报道相一致[8-9]。所建立的多种致泻性大肠杆菌基因芯片检测方法可作为一种有效的初筛方法应用于出入境检验检疫局、食品工厂等部门检查食品的安全，同时，为流行病学调查和传染性疾病的早期诊断和判定提供了一种有效的检测手段。

[1] Pat on AW,Pat on JC.Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by using multiplex PCR assays for stx1 stx2 enterh emorrhagic E coli hlyA,rfbO111 and rfbO157[J].J Clin Microbi ol,1998,36:598-602

[2] Kostrzynska M,Bachand A.Application of DNA microarray technology for detection,identification,and characterization of food2borne pathogens[J].Can J Microbiol,2006,52(1):1

[3] You Y,Fu C,Zeng X,et al.A novel DNA microarray for rapid diagnosis of enteropathogenic bacteria in stool specimens of patients with diarrhea[J].J Microbiol Methods,2008,75(3):566

[4] Call D R,Brockman F J,Chandler D P.Detecting and genotyping Es2 cherichia coli O157:H7 using multiplexed PCR and nucleic acid mi2 croarrays[J].Int J Food Microbiol,2001,67:71

[5] 顾大勇,孙虹,徐云庆,等.肠道传染病病原体可视化基因芯片检测技术的研究[J].中国国境卫生检疫杂志,2009,32(5):317－323

[6] Wu C F,Vald es J J.Biosensors and DNA microarray for discrimination between pathogenic O157:H 7 EDL933 and non-pathogenic Escherichia coli strains[J].B iosens Bioelectron,2003,19(1):1-8

[7] Sun H,Mo QH,Lin J C,et al.Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray[J].World J Microbiol Biotechnol,2011,27(1):163-169

[8] 史蕾,顾大勇,徐云庆,等.基于磁珠的可视化基因芯片在诺如病毒快速检测中的应用[J].中国热带医学,2009,9(4):596－610

[9] You Y,Fu C,Zeng X,et al.A novel DNA microarray for rapid diagnosis of enteropathogenic bacteria in stool specimens of patients with diarrhea[J].J Microbiol Methods,2008,75(3):566