奶牛布鲁氏菌病的诊断

乌伦吉如嘎，阿 青，哈斯毕力格

（1.内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古 包头 014109；2.内蒙古呼伦贝尔市鄂温克旗巴彦托海镇畜牧兽医站，内蒙古 海拉尔 021100；3.金宇保灵生物药品有限公司，呼和浩特 010030）

布鲁氏菌病（简称布病）是由布鲁氏菌引起的，以流产、早产等繁殖障碍和关节炎为主要特征的人畜共患传染病，是B类动物疫病。布病分布广，传染快，危害大，给畜牧业生产和人类健康带来极大的危害[1]。20世纪80年代布病疫情趋于平稳，甚至有些国家已宣布消灭了此病，但近年来有些国家和地区又开始暴发流行，我国人畜布病疫情明显回升，局部地区甚至出现暴发[2]。内蒙古曾是我国布病严重流行地区之一，目前布病疫情呈现明显回升之势[3]。

近几年包头市部分地区个体养殖户和养牛小区流产、早产等疑似布鲁氏菌病的奶牛比较多见。因此，为查明这些奶牛流产等是否由于布鲁氏菌病引起的，对某养牛小区进行了布鲁氏菌病诊断。

1 试验材料

1.1 病料

流产胎儿的肝、脾、肺、胎衣，流产母牛阴道分泌物、乳汁和血清。

1.2 培养基和试剂

胰蛋白胨琼脂培养基、肝浸汤、肝浸汤琼脂培养基、增菌液、布鲁氏菌阳性血清、布鲁氏菌阴性血清、布鲁氏菌虎红平板凝集抗原、试管凝集抗原、各种生化试剂及培养基等。

2 试验方法

2.1 抹片染色镜检

将病料切面在载玻片上抹片，自然干燥后用革兰氏染色法、萋-尼氏染色法和科兹洛夫斯基染色法染色，在显微镜下观察，布鲁氏菌为红色革兰氏球杆菌。

2.2 分离培养

将流产胎儿的肝、脾、肺、胎衣、母牛阴道分泌物及牛乳分别接种于增菌液培养基和肝浸汤培养基内，分别置大气条件和5%～10%CO2环境条件下，37℃恒温箱内培养3～7 d，划线转接于胰蛋白胨琼脂培养基和肝浸汤琼脂培养基上，观察菌落生长情况，如有菌落生长，对可疑菌落进行涂片染色镜检，再做纯化培养，并进行生化鉴定试验。如无菌落生长，则继续培养15～30 d。

2.3 病原菌鉴定

2.3.1 生化鉴定

将培养纯化后的细菌分别做微量糖发酵培养（葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、木糖）、甲基红（MR）试验、V-P试验、吲哚试验、尿素酶试验、明胶液化试验、柠檬酸盐利用试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、石蕊牛乳试验。

2.3.2 血清凝集试验

将分离出的细菌分别与布病标准阳性、阴性血清作凝集试验。在干净的载玻片上各滴1滴布病标准阳、阴性血清，然后用接种环取培养48 h的待检培养物少许，分别与阳、阴性血清混匀，1～2 min，用肉眼观察凝集反应，出现凝集颗粒反应呈阳性；不出现凝集颗粒反应呈阴性。同时设生理盐水对照。

2.4 血清学诊断

流产奶牛血清做虎红平板凝集试验和试管凝集试验，按照GB/T18646-2002的方法操作。

3 试验结果

3.1 镜检结果

流产胎儿组织脏器抹片，经革兰氏染色、萋-尼氏染色及科兹洛夫斯基染色镜检，2号和5号病料中发现单个、革兰氏阴性红色球杆菌，其余的病料未见可疑细菌。

3.2 分离培养结果

5份流产胎儿病料接种的增菌液培养基和肝浸汤培养基经培养后出现无色透明、细小、圆形、隆起的菌落，菌落表面光滑湿润，边缘整齐。其中2和5号病料接于胰蛋白胨琼脂培养基和肝浸汤琼脂培养基上初次培养只在5%～10%CO2环境条件下生长，大气环境条件不生长，但经传代后可在大气环境条件下生长；其余1、3和4号检样只在大气环境条件下生长，而在5%～10%CO2环境条件下不生长。

光学显微镜下观察发现，2和5号菌株革兰氏染色呈阴性球状小杆菌，单个存在；萋-尼氏染色呈鲜红色球杆状；科兹洛夫斯基染色为红色球杆状，符合布鲁氏菌的形态及染色特性（与病料染色镜检的结果一致）。

3.3 病原菌鉴定结果

3.3.1 生化鉴定结果

将分离出的5株菌进行纯培养后，分别接种于各种生化培养基上，经培养观察及试验鉴定，只有2号和5号菌株符合布鲁氏菌的生化特性，其生化鉴定结果见表1。

表1 生化鉴定结果

3.3.2 血清凝集试验结果

将分离出的5株细菌分别与布病标准阳性、阴性血清作凝集试验，结果2号菌株和5号菌株与阳性血清出现凝集颗粒呈阳性反应，其他3株菌没有出现凝集颗粒呈阴性反应；与阴性血清作凝集试验均没有出现凝集颗粒呈阴性反应，生理盐水对照组无凝集现象。

通过以上细菌形态、培养特性、生化试验、玻片凝集试验，从2号和5号检样中分离到的病原菌为牛种布鲁氏菌。

3.4 血清学诊断

血清学诊断结果见表2。

由表2可知，5份流产奶牛血清经虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测结果全部为阳性，且牛群未接种布鲁氏菌病疫苗，由此可以判定流产的5头奶牛已感染布鲁氏菌病。

表2 血清学诊断结果

4 讨论

对5份流产奶牛血清进行虎红平板凝集试验（RBPT）和试管试验（SAT）检测，结果全部呈阳性，RBPT和SAT阳性率均为100%。血清学诊断方法的特异性不强，有时可出现假阳性或假阴性现象，如需要确诊应结合其他诊断方法。

本次试验对5份流产奶牛病料进行了病原培养，分离出5株可疑菌落，其中2号和5号菌株经病原染色镜检、生化试验和血清凝集试验鉴定为牛种布鲁氏菌，病原培养阳性率40%。布鲁氏菌病是一种持续感染疾病，如早期得不到良好的治疗可转为慢性布病，病情时好时坏，引起波浪热[4]。病牛在发热期间才能排出病原体，且布鲁氏菌对培养条件要求较苛刻，所以病原分离培养的成功率不高。微生物学诊断方法可以确定其生物型，是最可靠、最确切的诊断方法，可对流行病学研究和疫情控制、消灭提供科学依据。

5 小结

综合各种诊断结果，确定2号和5号奶牛感染了布鲁氏菌病，该养牛小区奶牛流产的主要原因是由于布鲁氏菌病引起。布鲁氏菌病病畜在发热期间可成为传染源，排出病原菌，污染环境、用具、饲料和水源等，引起周围健康牛的感染[5-6]。应采取合理的防疫措施，防止疫情的扩散和蔓延。养牛小区应对全群奶牛进行布病检疫，感染牛应及时淘汰，同群牛隔离观察并定期检疫，污染的环境和用具等严格的消毒，流产的胎儿、胎盘和尸体要无害化处理；由于布病是人畜共患病，危害非常严重，所以对养牛小区的饲养人员、兽医等易感人群应采取相应的防护措施，必要时候免疫接种。对周围的动物食品交易市场、屠宰场、仓库等加强卫生监督，以防病畜及其产品流入而扩散疫情；加大宣传力度，加深对布病的认识；周围地区的动物进行布病的检疫，禁止由疫区购入动物及其产品和饲料等，避免带入布病；故意隐瞒疫情不报和转移病畜等违法现象应严格按照有关规定进行处理。

[1] 杨莲茹,乌伦吉如嘎,王建明,等.奶牛布鲁氏菌病病原PCR检测方法的建立[J].内蒙古农业大学学报,2008,28（2）:1-5.

[2] 杨海荣,关平原,范伟兴.AMOS PCR在布鲁氏菌种型鉴定中应用的研究[J].中国动物检疫,2007,24（10）:25-28.

[3] 吴从雅.内蒙古自治区布鲁氏菌病疫情趋势及原因分析[J].内蒙古地方病防治研究,1994,19（3）:101-102.

[4] 尚德秋.布鲁氏菌病再度肆虐及其原因[J].中国地方病防治杂志,2001,16（1）:29-34.

[5] 乌伦吉如嘎,杨连茹,杨富贵.内蒙古某养牛小区流产奶牛的布鲁杆菌病检测[J].黑龙江畜牧兽医,2011（8）:84.

[6]李向阳.内蒙古通辽地区奶牛布鲁氏菌病流行病学调查和感染机理初步分析[D].长春:吉林大学,2013.