岩溶洞穴微生物沉积碳酸钙——以贵州石将军洞为例<br/>

岩溶洞穴微生物沉积碳酸钙——以贵州石将军洞为例

2014-05-05蒋建建刘子琦贺秋芳段逸凡吕现福赵瑞一

生态学报 2014年8期

蒋建建，刘子琦，* ，贺秋芳，段逸凡，吕现福，赵瑞一

(1.西南大学地理科学学院，重庆 400715;2.西南大学地球化学与同位素实验室，重庆 400715)

岩溶洞穴沉积物尤其是石笋以其分布广泛、精确定年、高分辨率、可记录时间范围广及代用指标稳定丰富等优点［1］，成为古气候古环境重建的重要材料，洞穴沉积物碳氧同位素作为主要环境替代指标被学者广泛用于反映古气候和古环境信息［2］。沉积物δ18O 被普遍认为指示气候信息［3－5］，而自从 Cerling等土壤学家系统地论证了土壤CO2的δ13C反应地表C3/C4植物的分配比［6］，洞穴沉积物δ13C就被广泛用于反应地表植被状况，间接反映气候［7－8］。但洞穴沉积物δ18O、δ13C指标受到的影响因素众多，尤其是碳同位素信息存在异常分布，难以解释的现象［9－10］。而地球微生物学的兴起，使得贫营养化(富钙偏碱)的无光洞穴环境条件下的主要生存者和消费者——洞穴微生物，越来越受到重视［11－14］;并为解释同位素异常分布提供新的思路［15］。

自从土壤细菌能够沉积碳酸钙作为一种普遍现象被证实［16］，微生物沉积作用在许多条件下被发现，如湖相沉积物，海水［17－18］，而土壤中微生物沉积碳酸钙最为广泛［19］，当大气降水在流经洞穴上覆土壤、基岩时，会携带细菌进入洞穴，其对洞穴各种沉积作用的进行产生影响，如鹅管中真菌菌丝的发现，双U型沉积形态的形成都与微生物作用相关［11，16］。并且，随着分子生物学的发展并被引入地球科学，原始的洞穴沉积物中微生物沉积作用得以观察［20］，特别是近年来，分子化石的研究表明保存在石笋中痕量的来自生物体的类脂肪指标可以反映气候变化，而部分脂肪物来自微生物，且其他类脂肪物也呈现出微生物改造的迹象［21］;同时，洞穴微生物和化学过程协同作用可能是形成洞穴沉积物如石笋、钟乳石等的起始性过程［22－25］。我国南方发现大量文石类石笋［26］，文石及方解石石笋结构转变是否与洞穴微生物的成矿作用有关，微生物成矿作用受哪些条件控制，微生物形成碳酸钙晶体会对沉积条件产生怎样的影响，以及微生物沉积矿物的晶体特征是否有其区别于单纯化学沉积作用的独特性，该种独特性是否能成为辨别微生物沉积作用在原始洞穴沉积物存在的证据，最终微生物沉积作用是否对原始洞穴沉积物同位素信息产生影响。因此，开展洞穴微生物对洞穴沉积物形成过程中的影响研究，对利用石笋等洞穴沉积物重建古气候和环境研究具有重要意义。

本研究的前期，选取了贵州中西部的4个岩溶洞穴［27］，进行了洞穴微生物的取样筛选，几个洞穴中都筛选到能沉积碳酸钙的菌种，并在实验室培养中得到了方解石和球霰石为主的碳酸钙晶体，初步认为影响碳酸钙沉积的微生物在洞穴中普遍存在，其对洞穴沉积物的影响广泛存在，并对洞穴中沉积碳酸钙菌种的生化特征有初步了解。在此基础上，本研究选取了前期研究中沉积物发育较好，洞穴封闭，人为影响少的石将军洞，该洞穴未见任何地球微生物方面的研究报道，我们通过长期监测，已有同位素信息现代监测成果［28］，并初步获得了洞穴微生物方面的基本研究结果。本文结合该洞穴已有监测数据及基础理化背景资料，进一步利用B－4培养基(主要含Ca和少量有机物的贫营养培养基)及B－4C培养基(B－4培养基添加Mg)对洞穴沉积碳酸钙菌种进行培养、筛选以及对微生物形成沉积物进行鉴定［16］，分析微生物对培养体系的酸碱性、离子浓度、沉积量的影响，对比不同条件下微生物沉积矿物的晶体特征，对沉积碳酸钙菌种如何影响洞穴沉积作用做进一步探讨。

1 材料和方法

1.1 研究区概况

样品取自贵州省中部安顺市西秀区七眼桥镇屯堡寨村燕子窝村民组西北方向约100m处的石将军洞(SJJ)，该洞穴已有学者做过水化学等方面研究工作［29］。安顺市位于贵州省中西部(105°13'—106°34'E，25°21'—26°38'N)，是世界上典型的喀斯特地貌集中地区，处云贵高原东部的梯级状斜坡地带，属亚热带季风性湿润区，年均降水量1 360 mm，年均气温14℃。石将军洞海拔1 360 m左右，发育于三叠系中上统(T2－3)，为石灰岩、白云岩互层层组，所在地区石漠化严重，即岩石裸露，植被稀少，以少量的耐旱植物为主。

1.2 菌种的取样培养方法

微生物样品的取样方法，培养基(复筛培养基中B－4C液体培养基:醋酸钙2.5 g/L，酵母膏4.0 g/L，MgCl21.4 g/L，pH值8.0;除添加MgCl2作为Mg2+来源外，其余成分及条件与B－4培养基一致)，培养方法均见前期研究［27］。本研究从8个样品中纯化分离出58株菌种，从中筛选了18株能沉积碳酸钙的菌种，通过形态对比选取了5株菌种做沉积条件对比实验，图1为洞穴取样点分布图。

图1 洞穴取样点分布图Fig.1 Distribution of sampling points in Shijiangjun Cave

1.3 沉积物的鉴定方法

初步测试:用小勺取固体平板上的培养物，使用体积浓度1∶10的稀盐酸滴定，观察反应是否有气泡产生;鉴定:将液体培养基上钙化菌种产生的固体小颗粒物通过0.45 μm的滤膜过滤，在45℃下烘干，经X射线检测仪(简称XRD，型号Rigaku D;测角仪精度 0.02°;扫描范围－3°—160°)检测固体颗粒物的晶体成分。并将样品喷金处理后利用场发射扫描电子显微镜(简称 FEI－SEM，型号 FEI Nova 400 Nano SEM，分辨率:高真空模式1.0nm@15KV;1.8nm@1KV)进一步观察晶体结构特征，XRD及SEM测试均在重庆大学完成。

2 结果

2.1 固体培养基的初步结果

微生物样品取自石将军洞8个现代滴水监测点处的洞穴沉积物石笋、鹅管以及石钟乳等现代沉积物表面，经划线接种至B－4固体培养基上共筛选了58株不同的菌种，通过与前期培养实验获得的菌落形态特征对比［27］，筛选出了18株菌落表面能产生大量固体结晶或白色颗粒物的菌种，经稀盐酸检测菌落颗粒物，固体结晶物在稀盐酸中逐步溶解并产生无色细小气泡。图2为本次培养中筛选的具有广泛存在性及形态特征特殊的部分菌种，如SJJ－8－7，SJJ－1－2都是菌落呈乳白色并能产生大量白色颗粒物的菌种，并且在8个样品中都分离出了这类具有广泛存在性的菌种，SJJ－2－7菌落呈棕褐色褶皱状有结皮、生长速度快，SJJ－6－4 和 SJJ－6－1 菌落为灰白色有结皮、生长速度快，这类菌种在培养中占总筛选数的1/3，可能是优势种，后期液体培养时选取了该类菌种SJJ－7－7为验证菌种做了进一步培养;本研究同时选取了在以往取样中较少出现但在本次培养中成功培养且生长较快的菌种，如 SJJ－1－1、SJJ－7－3、SJJ－2－3，菌落特征分别为棕褐色有结皮、深褐色、红褐色，生长速度都较快并能产生固体颗粒物;SJJ－1－6为灰黑色霉菌状菌落，生长速度快，但无明显沉积现象。通过对菌落滴酸反应产生气泡的程度对比，初步选定 SJJ－2－3、SJJ－1－4、SJJ－7－7、SJJ－7－3、SJJ－8－7 等 5 株不同菌种进行液体培养以进一步研究其沉积作用。

图2 部分菌种B-4固体培养基上的形态特征比较Fig.2 Comparing characteristics of different cave bacteria species on the B-4 solid culture medium SJJ－1－2是指石将军洞一号样品中分离培养出的二号菌种，其余编号方法相同

2.2 洞穴滴水及沉积物特征

为更贴近真实洞穴条件，了解微生物取样点理化环境及沉积状况，对石将军洞滴水的基本理化性质进行了监测和分析，表1为5月份微生物样品取样时洞穴滴水的基本数据和洞穴环境的监测数据。8 个滴水点的 Ca2+/Mg2+质量浓度比分为2∶1(1、2、6、7)及 1∶1(3、4、5、8)两类，这与该洞穴相关学者所做的水化学研究结果一致［29］;此外，据张海伟等［30］对同一岩溶洞穴的研究表明影响石笋矿物类型的因素主要是滴水饱和度和Ca2+/Mg2+比值，本研究中设计了接近滴水Ca2+/Mg2+质量浓度比2∶1的B－4C培养基，分别将筛选出的5种菌种接种到B－4C培养基和B－4培养基，探讨微生物沉积碳酸钙矿物不同类型的离子条件，对比同时添加Mg2+和Ca2+与只添加相同量Ca2+的条件下微生物沉积碳酸钙矿物的不同晶体形态。同时，2011—2012年放置玻璃皿在滴水点下接收沉积物，发现4到5个月的沉积量在0.0049—0.0527g(1、3、4号点在监测过程中发现有明显沉积，但由于后期损坏未收集到玻璃皿)，呈白色薄层状，表明该洞穴监测到的几个点沉积作用发育;并且，各个滴水点附近的CO2分压较低，都在600mL/L以下。

表1 石将军洞洞穴滴水和环境监测数据(2012年5月)Table 1 The drip water and environmental monitoring data of Shijiangjun Cave

2.3 室内微生物沉积晶体结果

2.3.1 沉积量

经B－4及B－4C液体培养基28℃避光恒温培养18d后，大多数样品中都有结晶小颗粒出现，而阴性对照中有少量絮状物，没有固体颗粒物形成，表明B－4培养基虽然为含Ca2+的弱碱性液体，但在该实验体系中Ca2+较为稳定，自然条件下不会因为CO2的溶入而沉淀。用0.45 μm微孔滤膜将培养物过滤，经烘干处理后称重，接种过微生物的培养液过滤后滤膜与原始对比增重量是不接微生物空白对照的10—50倍(表2)，这表明微生物能够显著改变实验体系。此外，称重结果显示大多数接种过微生物的B－4C培养基沉积物的量比B－4培养基的多。通过对经过滤烘干处理后沉积物量的比较，选取了两种不同培养基产生几乎相同沉积量的 SJJ－7－7、SJJ－8－7 和沉积量有较大差别的SJJ－2－3，分别做XRD矿物成分分析及SEM矿物晶体形态分析。

2.3.2 钙镁离子及pH值

测定培养基滤液的Ca2+浓度，发现接种过微生物的培养液Ca2+浓度下降了50%—90%，而Mg2+浓度最多降低25%(表2)。而且，接种的B－4C培养基滤液普遍要比同种细菌 B－4培养基滤液 Ca2+浓度高。

测定培养基滤液pH值，发现滤液的pH值普遍升高，所得沉积量越多，pH值增幅越大。如SJJ－8－7在两种培养基内获得的沉积量最多，同时SJJ－8－7滤液pH值增幅也最大，其中 B－4培养基中 pH值9.08，相对空白对照pH值8.02增幅为1。大多数接种的B－4C培养基沉积物的量比B－4培养基的多，其滤液pH值增幅也较大(表2)。

表2 培养基过滤后增重量及培养液pH值、离子浓度Table 2 Medium increment in weight after filtering and pH，ionic concentration of culture solution

2.3.3 室内微生物沉积晶体形态及特征

XRD分析(图3)表明培养基中沉积矿物主要为方解石、球霰石及方解石的混合和球霰石。B－4和B－4C两种培养基上形成的晶体形态截然不同，即使形成同种矿物，其XRD谱峰和晶体形态也有明显差异。如SJJ－2－3菌种在两种培养基上都形成了方解石晶体，XRD图谱也显示矿物均为方解石，但其谱峰强度有很大差别。对比SEM图(图4)发现，B－4C培养基下形成了规则的六方柱形单晶，而在无Mg2+的B－4培养基上形成的是不规则方解石。对于同一菌种，只含Ca2+的B－4培养基上形成了不稳定的球霰石或球霰石和方解石的混合物(SJJ－2－3形成的是不规则无定形方解石)，而在同时含有Mg2+和Ca2+的B－4C培养基上只形成了方解石。

SEM图中显示，本研究中微生物沉积形成多种碳酸钙矿物晶体形态，如不规则六方体、柱状体、四方体层状、斜六方体、半球状以及几何与半球结合形态。如SJJ－7－7在B－4C上的半球状球霰石附着很多较小的圆饼状球霰石(图4)［31］，图4 中 SJJ－7－7 在 B－4上形成的形态规则的晶体。此外，晶体结构也有明显微生物作用的痕迹，如SJJ－7－7中，B－4C 培养基上的晶体表面有2—3μm类细菌大小的明显凹陷(图4)。

图3 晶体XRD谱线图Fig 3 XRD measurements of the crystals图中 SJJ－2－3(B－4)、SJJ－2－3(B－4C)分别指 SJJ－2－3 菌种在 B－4、B－4C 培养基下形成的晶体 XRD 谱线，其余编号方法相同

图4 微生物沉积矿物SEM图Fig.4 SEM images of microbial mineral precipitation图中 SJJ－2－3(B－4)、SJJ－2－3(B－4C)分别指 SJJ－2－3 菌种在 B－4、B－4C 培养基下形成的的晶体形态，其余编号方法相同;a:SJJ－7－7(B－4C)图中箭头所指的2－3um类细菌大小的凹陷;b:SJJ－7－7(B－4)箭头所指圆饼状球霰石;c:SJJ－7－7(B－4)方解石规则晶体形态

3 分析与讨论

3.1 影响沉积量原因分析

称重结果表明，沉积量在不同类型的培养基上有很大差别，主要表现为同种菌在B－4C培养基上沉积量比B－4培养基上普遍要多，相应地，其滤液Ca2+浓度也较高。滤液Ca2+浓度降低可能会促使沉积作用发生，这可能因为微生物沉积碳酸盐过程中移除有毒性的Ca2+是生理性的适应过程，这种作用形成了洞穴原始沉积晶体成核的作用位点，而这些晶体成核点有利于洞穴次生碳酸钙的形成［15］。此外，本实验中，B－4C培养基中添加Mg2+可能会减轻Ca2+对细菌的毒性压力，而表现出B－4C培养基滤液中Ca2+的移除较少。对Ca2+的移除需求可能是影响微生物沉积作用发生的关键之一。

pH值测试结果表明，培养基滤液pH值增幅可能与沉积量之间有一定的联系，为进一步验证，对沉积量与pH值之间做相关性分析。结果表明，如果基于阴性空白对照则两种培养基整体表现出沉积量与pH值极显著相关(α=0.01)，考虑温度及测量误差等因素，也有很好的相关性;此外，如排除空白对照，整体上，沉积量与pH值之间基本没有相关性，但B－4培养基体系两变量之间仍有较好的相关性(α=0.1)(图 5，SJJ－1－4(B－4C)沉积量收集时滤膜破损，故未计入相关性分析)。因此，微生物改变实验体系的pH值可能是影响碳酸钙沉积量的重要因素之一。

图5 沉积量与pH值相关性分析Fig.5 Correlation coefficients between precipitation weight and pH

综上所述，pH值和Ca2+浓度可能对微生物沉积碳酸钙起着至关重要的作用，根据已有研究，碳酸钙沉积过程受Ca2+浓度、溶解无机碳(DIC)、pH值和可利用的成核位点4个基本的化学因素影响［32－33］。本研究中培养基滤液的Ca2+浓度显著降低，而Mg2+浓度基本未受到微生物作用的影响;同时，添加Mg2+的B－4C培养基滤液中Ca2+的移除较少。这可能与微生物沉积过程中对钙离子的代谢会减轻Ca2+对微生物生理性的毒性压力有关，而Mg2+并不参与微生物代谢过程或者对微生物生存不产生致命性的压力;因此，微生物对钙离子的代谢可能是沉积作用发生的关键之一［34］。此外，培养基滤液pH值与沉积量的相关性表明，细菌的生长可能极大地推动着液体介质的pH值增高，而pH值的增高有利于碳酸钙沉积的发生［35］;但微生物对 Mg2+代谢表现出的复杂性，说明微生物沉积碳酸钙的控制因素不只是pH值和对钙离子的代谢作用。

3.2 矿物分析

XRD分析及SEM结果表明，同一菌种在两种不同的培养基上沉积的矿物晶体形态及特征都不同。这两种培养基的差别主要表现在B－4培养基只添加了Ca2+，而B－4C培养基中同时添加了相同量的Ca2+及一定量的Mg2+。B－4培养基上沉积的碳酸钙主要为球霰石、球霰石和方解石的混合物、不规则无定形方解石等不稳定的晶体;B－4C培养基则形成了六方柱形等规则方解石的稳定晶体。可能因为添加Mg2+有利于整个实验体系趋于稳定，而更易于方解石等稳定晶体的沉积。在前期研究中，对其他菌种的研究也表明不加Mg2+或者Ca2+浓度越高可能更易于形成球霰石或球霰石和方解石的混合［27］。

石笋矿物结构转变的研究［30，36］发现 Mg2+的存在诱导碳酸钙结晶向文石转变，但本研究中Mg2+的存在似乎更有利于碳酸钙沉积物向稳定的方解石转变，而不是文石。然而，尽管在本研究及前期研究中均没有发现文石的存在［27］，但在石将军洞中却发现过文石石笋［28］。本研究中通过对比现代洞穴监测数据及参考其它同类研究，实验是在28℃下避光培养的，其他同类研究中都有文石的形成［15－16，19，22］。可能碳酸钙的这种高压稳定相文石晶体的形成，不仅受各种化学离子的调控，同时受所处空间和环境温度等因素的影响。周根陶等［38］指出文石型碳酸钙本身是亚稳变体，在水溶液中很快经过同质多象转变成稳定的方解石相。本研究为液体培养基，微生物沉积碳酸钙过程中可能有文石出现，但在液体培养体系中可能很快转变为方解石，而未能在最终结果中显现。

SEM图分析表明，微生物作用沉积的碳酸钙晶体形态区别于单纯化学作用下形成的三方或六方规则方解石等碳酸钙晶体。由于晶体的结构不仅受所处空间环境的控制，而且受微生物分泌物、培养基pH值及添加的离子等多种因素影响，因此微生物在室内实验体系下形成了多种不同的晶体结构。Wang等［35］发现，碳酸钙矿化过程中微生物存在逃逸机制，微生物在沉积碳酸钙后可能会从矿物中逃逸出去，微生物的此种机制可能最终影响着矿物的形态。此外，晶体结构表面微生物作用痕迹也很明显，进一步表明微生物对沉积作用产生重要影响。成亮等［36］的研究表明细菌分泌物对晶体形貌影响很大，而细菌体在六方体碳酸钙晶体表面留下孔洞，但对晶体几何形态几乎没有影响，这与本研究中的矿物形态一致。

综合XRD及SEM图谱表明，SJJ－2－3和同样接种在 B－4 培养基上的其他两种菌种 SJJ－7－7 和 SJJ－8－7产生的矿物晶体不同，只形成了碳酸钙稳定的方解石晶体;SJJ－7－7 和 SJJ－8－7 在此种培养基上分别形成了方解及石球霰石的混合物和单纯的球霰石。然而，对比培养过程中产生的沉积量和pH值的变化，SJJ－2－3在 B－4培养基和 B－4C 培养基产生的沉积量都少于 SJJ－7－7 和 SJJ－8－7 在同种培养基上产生的沉积量，并且SJJ－2－3培养液的pH值增幅相对其他两种菌种也较小。这些现象表明，不同菌种对实验体系的扰动强度不同，进而对体系的pH值产生作用，pH值增幅越大体系越趋于不稳定，体系越不稳定可能更利于沉积作用的发生，从而产生更多的沉积量。如 B－4 培养基的 pH 值增幅从 SJJ－2－3、SJJ－7－7 和SJJ－8－7依次增大，而表现出晶体结构的变化从稳定相的方解石、方解石和球霰石的混合到单纯的球霰石这种在自然化学作用下很难形成的碳酸钙不稳定相，并且，相对地沉积量也有增多的趋势。沉积量与pH值相关性分析也证实了这一点。

对比本研究的实验条件，培养条件都是在洞穴微生物最适生长的温度28℃下［22］，初始培养基pH值8.0［16］，除 B－4C 培养基同时添加 Mg2+和 Ca2+，B－4培养基只添加相同量的Ca2+外，而表现出的这种晶体形态差异，可能不仅与添加Mg2+的诱导及不同微生物对实验条件改变有关，而且和整个实验体系的扰动程度相关。因此，本研究后续实验将改变培养液长期静置的状况，通过模拟洞穴滴水及其沉积物形成条件，最终确定微生物沉积碳酸钙的晶体形态受哪些因素影响。

3.3 讨论

碳酸盐类矿物形成必须满足两个条件，即水体中碳酸盐达到饱和及有足够的有效成核位点。也就是说，理论上凡能提高矿物饱和指数并且能提供成核位点的微生物作用均能促进碳酸盐沉淀的形成［14］。本研究中培养基体系的pH值增幅越大，相对地沉积量也越多。这种高幅度改变实验体系的酸碱度，与微生物通过代谢活动大幅度提高所处环境pH值以便Ca2+达到饱和状态从而排除其毒性的压力有关［15］。微生物移除Ca2+的代谢生长过程中，代谢产物可能为洞穴沉积作用的发生提供成核位点等先决条件［22］。同时，这也为石将军洞现代监测中洞穴滴水“旱季滴水pH值低，雨季滴水pH值高”［39］的反常现象提供某种程度上的解释，即雨季时，洞穴微生物作用加强而基于代谢需要反而使滴水pH值普遍增高，反之亦反。

微生物沉积碳酸钙晶体成分及形态分析显示，微生物作用沉积的碳酸钙，与单纯化学作用下形成的碳酸钙晶体形态有很大区别，并且，Mg2+对碳酸钙晶体形态产生重要影响。石将军洞发育于灰质白云岩和白云质灰岩，洞穴滴水和池水中Mg2+的含量都很高，而微生物普遍参与沉积作用，这可能会加强微生物沉积碳酸钙作用对石笋等现代次生化学沉积物形成过程的影响。此外，已有研究表明微生物作用沉积碳酸钙会导致偏负的碳、氧同位素［40］。因此，在利用石笋等次生化学沉积物恢复和重建古气候和古环境时，尤其在考虑碳同位素信息影响因素众多，微生物作用又与其他因素相互耦联发生作用的条件下，微生物沉积作用不容忽视。那么，查明微生物沉积作用造成碳同位素的分馏信息尤为关键。本研究后续将利用微生物作用过程并结合动力作用来模拟洞穴环境下的沉积作用，以进一步探讨微生物沉积作用如何影响洞穴沉积物的同位素信息。

4 结论

本研究对比了B－4和B－4C培养基上微生物形成碳酸钙的晶体形态结构及培养过程中培养基理化性质的变化，发现洞穴微生物中沉积碳酸钙的不同菌种可能对实验体系的稳定性扰动程度不同。而且这种扰动程度反应在对各理化性质的改变幅度，最终对形成的晶体结构产生作用。结合XRD晶体成分分析及SEM晶体结构分析，得出以下结论:

(1)本研究实验条件下，微生物在B－4培养基上随着培养基pH值增幅的增大，主要形成了以方解石，方解石和球霰石的混合物以及球霰石为主的晶体。

(2)B－4C培养基上的3种菌种产生的矿物主要以单一的方解石为主，添加Mg2+可能有利于抑制微生物对培养基体系的扰动，而形成稳定的碳酸钙晶体——方解石。

(3)本研究中并没有文石晶体出现。

(4)通过SEM观察到多种不同矿物的晶体结构，而这种结构较少见于化学作用更多是生物作用下形成的碳酸钙晶体结构。同时，各个晶体结构中都有微生物的作用痕迹，细菌作用可能贯穿于整个晶体形成的过程中。

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