高山被孢霉发酵生产花生四烯酸的宏观形态

代 军，赵根海，王 鹏，刘 会，宋均营，胡以华，郑之明

(1.中国科学院 合肥物质科学研究院 离子束生物工程学重点实验室，合肥 230031;2.解放军电子工程学院，合肥 230037)

微生物油脂又称单细胞油脂(SCO)，是指某些微生物在一定条件下将碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂等C源转化为菌体内大量储存的油脂，并且油脂量一般占菌体干质量的20%以上。产油脂微生物主要有酵母、真菌、微藻和细菌，其中以对酵母菌和丝状真菌的研究居多，少数产油微生物能在胞内积累超过细胞干质量70%的油脂［1－2］。早期微生物油脂的研究主要集中在功能性油脂的开发上，随着国际能源危机和国内生物柴油产业面临的原料困境，以微生物油脂进行生物柴油生产的研究日益受到关注。微生物发酵法与依赖油料植物获得油脂的传统方法相比，有周期短、不受季节和气候影响、原料来源广泛、潜力大等优点，具有广阔的工业化应用前景［3］。高山被孢霉(Mortierella alpina)由于胞内合成的油脂富含一种功能性多不饱和脂肪酸花生四烯酸(ARA)而备受关注［4］。

在丝状菌的深层发酵过程中，菌丝的形态结构会显著影响发酵液的流变性质。当菌丝呈球状生长时，培养液黏度较低，通常发酵液表现为牛顿型流体特性，在深层培养中的动量、热量和质量传递较为容易，当球逐渐增大时，菌丝球由外到内形成营养梯度，营养成分向球中心扩散受到限制，内部菌丝体的代谢产物的生产下降［5－7］;而当菌丝呈丝状生长时，发酵液黏度较高，发酵液表现为非牛顿流体特性，液体流动性差，导致动量、热量和质量传递困难，容易因混合不充分造成气液相间传热和传质不良，最终也会影响代谢产物的生产［8］。菌丝体微观形态的微小差异都有可能导致宏观发酵行为的显著差异，实现发酵过程中理想的形态控制是发酵调控的重要途径［9］。对影响形态的因素，国内外研究人员已经进行了大量研究，结果表明溶氧、N源种类、消耗的C/N比、无机盐离子和氨基酸的添加等因素都会影响到菌丝的形态［10－13］。虽然，形态的重要性无可置疑，但培养基成分、形态发生及微生物产ARA水平三者间的关系还不太明晰，将其关联起来进行的研究更是鲜有报道。

笔者所在实验室通过氮离子注入获得Mortierella alpina I49-N18，对其发酵过程中的不同形态与产ARA能力进行研究，并采用图像处理方法对形态参数进行量化分析，旨在为下一步对菌丝球形态控制研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

石油醚(沸点30～60℃)市售分析纯，SBA-50B型生物传感分析仪(山东省生物技术研究中心)，250 mL直滴式索式提取器(郑州中天实验仪器有限公司)，体视镜(日本Olympus公司)，GC-14C气相色谱仪(Shimaozdu公司)。

1.2 菌种与培养方法

高山被孢霉(Mortierella alpina)I49-N18，中国科学院离子束生物工程学重点实验室保存。平板保存培养基:马铃薯(PDA)培养基。摇瓶发酵培养基(g/L):葡萄糖 80、不同 N 源((NH4)2SO4、NH4Cl、NaNO3、KNO3、酵母粉、蛋白胨、玉米浆和蛋白胨 +酵母粉)20，pH 8.5。培养基115℃、灭菌30 min。菌种在平板PDA培养基上28℃培养7 d，用少许无菌水洗脱，玻璃珠振荡至形成分散的孢子悬液，按10%接种量接入含有50 mL培养液的250 mL三角瓶中，180 r/min、28 ℃培养 7 d。

1.3 分析方法

生物量测定:用纱布将发酵液过滤，并用水冲洗几次，在80℃烘箱烘干至恒质量，称干质量。

菌体总脂测定:利用直滴式索式提取法测定。具体方法为干菌体用研钵磨碎成粉末后，取1.0～1.5 g，在索氏提取器中，石油醚60℃不断回流提取(6 h)，收集全部回流液，再旋转蒸发回收石油醚;80℃烘干，称干质量，计算油脂比例。

花生四烯酸比例测定:参照文献［14］，利用气相色谱法测定。

发酵液残糖浓度测定:采用SBA-50B生物传感分析仪进行离线葡萄糖测定，检测范围在0～1 g/L。

1.4 形态参数的获取

各种形态的发酵液中，随机取20个菌体用体视镜进行图像采集，利用菌丝体显微图像分割及特征提取软件(2011R11S044664)，先进行灰度运算，使图像对比度增强，再经过全局二值化运算去除背景和噪声，得到黑白图像，根据图像中不同的灰度值，通过阈值调整得到成核区域，分别计算其成核区域面积(Apc)与整个菌体投影面积(Am)，并计算其比值，用来衡量菌体形态的蓬松程度。菌体直径Dm利用Image J2x软件计算。

2 结果与讨论

2.1 单一N源对形态的影响

考察不同N源发酵对被孢霉的形态的影响，结果见图1。由图1可知:加入不同N源进行发酵，被孢霉的形态差异明显。当无机氮作N源时，菌体不生长，有机氮作N源时，菌体形态呈现出很大区别，主要分为两类:一类是酵母粉或玉米浆作N源时，菌体形成分散菌丝(图1(a));另一类是蛋白胨作N源时，菌体形成球形(图1(b))。

图1 单一N源下高山被孢霉的宏观形态(×8)Fig.1 Macro-morphology of M.alpina under sole nitrogen source(dispersed mycelia and hollow pellets)(×8)

2.2 复合N源对形态的影响

2.2.1 不同宏观形态分析

分别按照表1中的比例添加蛋白胨和酵母粉作为复合N源，进行发酵，观察菌体形态，形态特征数据见表1，菌体宏观形态见图2。

表1 复合N源下菌体宏观形态的形态特征Table 1 Macro-morphologicalcharacteristic parameters under complex nitrogen source

由表1可知:复合N源中蛋白胨与酵母粉比例降低，菌体形态明显不同，总的变化为Apc/Am降低，菌球的成核区域比例越来越小，菌球的蓬松度增加，单个菌体的直径变大。蛋白胨与酵母粉比例为3∶1时，菌体形态为球形，成核区域占81.1%;比例为2∶1时，菌体形态也为球形，但成核面积只占43.6%;比例为1∶2时，菌体形态完全为分散菌丝，不存在成核区域;菌体形态为球形时直径大致相同，4.3 mm左右;形态为分散菌丝时，直径增至6 mm。虽然蛋白胨与酵母粉比例为3∶1和2∶1时菌体形态都为球形，但成核区域直径和单个菌球的紧密度差异明显，分别为3.88 mm、42.27和2.91 mm、71.36。空心球形形态由于成核区域直径较大，菌球中心部位菌丝因为营养缺乏而自溶，形成空心球，同时其葡萄糖利用率只有55%;蓬松球形态的菌丝不存在营养缺乏等问题，形成蓬松球，其葡萄糖利用率高达97%。上述结果表明，蛋白胨有利于菌丝聚集成球，酵母粉有利于菌丝顶端生长，形成辐射状菌丝，其原因可能是，酵母粉作为速效N源，含有丰富的生长因子、维生素、核苷酸等适合菌丝快速萌发生长的微量物质，蛋白胨作为缓效N源，不利于菌丝快速生长，菌丝生长过程中容易聚集在一起。因此，在高山被孢霉发酵过程中，确定复合N源中蛋白胨和酵母粉的比例对形成合适的菌体形态至关重要。

图2 复合N源下高山被孢霉的3种典型宏观形态(×8)Fig.2 Three typical macro-morphologies of M.alpina under complex nitrogen source(×8)

2.2.2 宏观形态对菌体产ARA能力的影响

高山被孢霉在蛋白胨与酵母粉比例不同的复合N源中以不同的形态生长，发酵结束时对生物量、油脂比例及ARA比例进行测定，具体结果见表2。

由表2知:菌体形态以空心球形态生长时，生物量最低，菌体油脂比例最高，ARA比例较高;以蓬松球形态生长时，生物量最高，菌体油脂比例较高，ARA比例最高;以分散菌丝生长时，生物量较高，菌体油脂比例及ARA比例最低。ARA量由生物量、油脂比例及油脂中ARA比例共同决定，因此球形形态菌体ARA产量比分散菌丝菌体ARA产量高，特别是以蓬松球形态生长时，其ARA产量达2.98 g/L，分别是空心球和分散菌丝的2.01和2.70倍。

表2 菌体的不同宏观形态对ARA合成的影响Table 2 Effects of different macro-morphologies on mycelial lipid production

ARA作为一种多不饱和脂肪酸，虽然不是含氮化合物，但其比例与N源种类密切相关，其在菌体内的合成需要多种延长酶和脱饱和酶参与，此过程对O2的依赖程度非常高［15］。由表2知，随着复合N源中酵母粉比例的增加，生物量和ARA比例增加，形态由球形变为分散菌丝。当菌体以分散菌丝形式生长到中后期，发酵液黏度非常大，不利于发酵液中营养和O2等的传递，菌体生长受到抑制，同时也不利于ARA合成，因此生物量和氨基酸比例都有所降低。

Park 等［11］和 Koike等［12］研究了消耗的 C/N 及不同N源对高山被孢霉形态和ARA产量的影响，但未对菌体形成不同形态的原因展开分析，本研究通过调节复合N源中蛋白胨与酵母粉比例，得到了相对连续的菌丝体形态变化过程，即菌丝体的成核区域比例由81.1%(空心球)降为43.6%(蓬松球)，最后为0(分散菌丝)，显示了不同形态间的内在联系，结合不同形态下菌丝的生长情况发现速效N源有利于形成分散菌丝，迟效N源倾向于使菌丝聚集。因此，调节两类N源的比例，有助于筛选最适于目标产物生成的发酵形态。本研究发现，当复合N源中蛋白胨与酵母粉比例为2∶1时，高山被孢霉菌体形态为类似菊花瓣状蓬松球，其为最适合油脂积累及ARA转化合成的发酵形态。

3 结论

蛋白胨、酵母粉这2种N源是影响高山被孢霉宏观形态的重要因素，当复合N源中蛋白胨与酵母粉比例很高时，菌体形态为空心球，比例适当时为“类似菊花瓣”的蓬松球，比例很低时为分散菌丝。高山被孢霉不同的发酵形态，其菌体产ARA能力存在较大差异。ARA作为一种胞内产物，产量由菌体生物量、菌体油脂比例及油脂中ARA比例共同决定。当高山被孢霉以分散菌丝形态生长时，菌体产ARA能力不如球形形态;而空心球的菌体生物量低，蓬松球可以兼顾菌体高生物量、高油脂比例及高ARA比例，因此具有很高的产ARA能力，其产ARA能力分别是空心球和分散菌丝的2.01和2.70倍。综上所述，菌体形态特征为直径大约4 mm、Apc/Am为0.436、投影面积为15.27 mm2、成核区域直径2.9 mm、紧密度大约为71.36的蓬松球，是高山被孢霉发酵过程中适合油脂积累及ARA转化的典型形态，既排除了空心球中心部分的传质及空气传递等问题，又不会因为过多的分散菌丝导致发酵液黏度变大，从而有利于工业生产过程中发酵液搅拌及下游湿菌体的分离。

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