一株乳酸杆菌的选育

张开磊，王宝维

（青岛农业大学优质水禽研究所，国家水禽产业技术体系营养与饲料功能研究室，山东 青岛 266109）

乳酸菌是一类能从可发酵性碳水化合物中产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称，广泛存在于人、畜、禽肠道、许多食品、物料及少数临床样品中[1]。因其独特的生理学功能及对动物的益生作用，正日益引起人们的重视[2]。马治宇研究证明，乳酸菌可以改善雏鸡日增重和料肉比，王晶等研究证实，乳酸菌能提高肉仔鸡的免疫力[3]。目前，微生物发酵饲料处于新兴阶段，选择合适的发酵菌种，决定饲料品质的优劣。选择发酵饲料的菌种生长速度和产酸量是试验选择的关键。本试验对市售酸奶进行乳酸菌分离，并对分离菌株的生长速度、产酸性能及生化指标进行了检测，为该乳酸菌进一步推广应用提供一定的基础依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

酸奶由本地超市购买，为内蒙古伊利公司生产的发酵乳。

1.2 试验试剂及配制方法

MRS液体培养基（pH 6.8）：蛋白胨10 g，牛肉浸膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1mL，柠檬酸氢二胺2 g，MnSO4·H2O 0.25 g，MnSO4· 7H2O 0.58 g，K2HSO42 g，蒸馏水 1 000 mL，加海水晶15 g，调pH后121℃灭菌20min。

0.9 %NaCl溶液：称取NaCl0.9 g，溶于100mL水，121℃灭菌20min。

20%CaCO3乳浊液：称取CaCO320 g加入到100mL蒸馏水中，制成CaCO3乳浊液。

革兰氏染色法各种染液的配制：结晶紫染液，结晶紫2.0 g、草酸铵0.8 g、95%酒精20mL、蒸馏水80mL，先将结晶紫溶于酒精，草酸铵溶于蒸馏水中，然后将两液混合，静置48 h，此染液稳定，置密闭的棕色瓶中可储存数月；革兰氏碘液，碘1.0 g、碘化钾2.0 g、蒸馏水300mL，先将碘与碘化钾混合，加水少许，略加摇动，待碘完全溶解后再加蒸馏水至定量；脱色剂为95%酒精；复染剂为番红（沙黄）染液，沙黄0.25g、95%乙醇10mL、蒸馏水适量，将沙黄溶解于95%乙醇中，待完全溶解再加蒸馏水至100mL。

1.3 菌种的分离纯化

在超净工作台无菌条件下，将酸奶用无菌水稀释，梯度为1∶10。取0.2mL涂布于改良MRS琼脂上（培养基上加入CaCO3乳浊液1mL），30℃厌氧培养，直到出现CaCO3溶解圈的菌落，然后重复划平板分离出单菌落。

1.4 分离株菌落形态特性及生化鉴定

挑取单菌落接种于MRS液体培养基，培养24 h后观察菌株的菌体形态，然后进行革兰氏染色，同时对菌株进行耐氧、产酸、试管凝集和固体发酵检测试验，并用乳酸菌生理生化微量发酵管进行生化鉴定。

1.5 乳酸菌生长曲线

根据费翅鲲等在MRS液体培养基中加入5%的菌液后，测定OD690nm值，每隔2 h取1次菌液检测其OD690nm值，绘制乳酸菌生长曲线[4]。

1.6 乳酸菌酸度

酸度以吉尔涅尔度（oT）表示，即每100mL发酵液消耗1mL 0.1mol·L-1NaOH溶液记为1oT[5]。测定时，将0.1mol·L-1NaOH溶液装入碱式滴定管中。用移液管分别吸取上述不同时间段的菌液2 mL于小烧杯中，将标定好的精密酸度计探头插入烧杯中，使探头与菌液充分接触。然后一边用氢氧化钠滴定一边注视酸度计读数，以pH刚好为7时停止滴定，记下所用NaOH溶液的量，算出相应的吉尔涅尔度，绘制酸度变化曲线。

2 试验结果

2.1 分离株形态鉴定

乳酸菌在MRS培养基上的菌落特征见图1。

图1 乳酸菌在MRS培养基上的菌落特征

由图1可见，从样品中共分离出20株能产生溶解圈的菌株，纯化后在MRS培养基上形成表面光滑、边缘整齐、中央隆起、易于刮起的直径约1mm的奶油状菌落。经过半固体琼脂菌株的运动性检穿刺试验证明，菌株均生长于接种的穿刺线上，边缘清晰，无扩散现象，表明均无运动性。

2.2 细菌形态观察

显微镜下乳酸菌形态见图2。

图2 显微镜下乳酸菌形态

将分离菌株进行革兰氏染色，油镜下可见两端平直的革兰氏阳性杆菌，单个或呈短链排列。

2.3 乳酸菌液体培养结果

接种细菌试管与对照试管的比较见图3。

由图3可见，本试验中接种细菌的试管变浑浊，对照试管澄清，由此可知，接种细菌的试管内为乳酸菌，无杂菌污染。

图3 接种细菌试管与对照试管的比较

2.4 分离株生理生化鉴定

分离株生理生化特性见附表。

附表 分离株生理生化特性

该分离株无鞭毛、无芽孢、革兰氏染色呈阳性，在30℃厌氧条件下培养48 h能长出乳白色扁圆形凸状菌落。将该分离株接种到脱脂乳试管后，置于42℃恒温培养箱中培养24 h，脱脂乳凝固但无气泡产生，测定pH呈酸性。将该分离株乳酸发酵后，产物经硫酸和高锰酸钾处理，可使含氨硝酸银滤纸条变黑。对分离菌株进行微量生化反应管鉴定[6]。结果显示，该菌株对葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、甘露醇、山梨醇、七叶苷和水杨苷反应呈阳性，对精氨酸双水解酶、明胶液化和还原性硝酸盐反应呈阴性。上述特征表明，该株分离菌为乳酸菌属[7]。

2.5 乳酸菌生长曲线测定结果

乳酸菌生长曲线见图4。

由图4可知，当加入5%的菌液后，测定OD690nm值为0.436，前18 h乳酸菌繁殖迅速，OD690nm值持续上升，乳酸菌浓度逐渐增大，20～36 h时菌体密度基本一致，乳酸菌处于生长稳定期。

2.6 乳酸菌酸度测定结果

乳酸菌产酸量的测定见图5。

图5 乳酸菌产酸量的测定

由图5可知，从接种到20 h，培养液中的pH持续下降，说明此刻乳酸菌处于生长对数期，持续产酸；20 h后稳定约为3.64，此刻乳酸菌处于生长稳定期，产酸量降低。这与图4生长曲线一致。

3 讨 论

自20世纪80年代以来，随着我国养殖业连续20多年以年均增率＞9%的高速度增长，畜牧生产区的饲料资源短缺问题也将越来越严重[8]。因此，积极开发新的饲料资源，提高现有饲料利用率已迫在眉睫。微生物发酵饲料可改善饲料的营养价值，提高动物生产性能，从而提高饲料利用效率。王春林等研究证明，发酵饲料可显著提高猪的生产性能和屠宰性能[9]。选择合适的发酵菌种是微生物发酵饲料成功关键。菌种本身不能产生有毒物质，符合安全性的原则；并且菌体本身具有很好的生长代谢活力，能有效地降解大分子物质和抗营养因子，合成小肽和有机酸等有益物质[10]。

研究表明，乳酸菌具有改善肠道功能、提高机体免疫力、改善机体营养状况等作用[11]。其中改善营养状况、提高免疫等作用已在食品、医药方面广泛应用。乳酸菌在畜牧业中应用，可提供营养物质，改善消化道微生态环境，调节消化道免疫系统[12]。大量研究证明，乳酸菌对人和动物体保健和治疗都有较好疗效。张骁勇在育成梅花鹿饲粮中添加未调酸的乳酸菌添加剂，结果表明，添加未调酸的乳酸菌添加剂10 g·d-1·头-1，能提高梅花鹿采食量[13]。

本试验通过对此株乳酸菌株采用形态学、生理生化特性和运动性等鉴定，根据鉴定手册可以初步判定属于乳杆菌属，其形态与乳酸链球菌相符，鉴定该乳酸菌可能为乳酸链球菌，但还需后续试验证明其是否是乳酸链球菌。本试验中采用OD690nm值来反应乳酸菌菌液的浓度，虽然不能得知菌体的数量，但在一定程度可以对比不同时间下的菌体浓度，且操作迅速，简便。

乳酸菌在其生长繁殖过程中能够产生乳酸，乳酸能够降低动物肠道pH；可以提高钙、磷、铁的利用率，并促进铁和维生素D的吸收；肠道pH降低可有效抑制致病菌，如痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、弯曲杆菌、葡萄球菌等的生长，为有益菌的生长创造了条件[14]。培养液pH动态变化主要是由乳酸菌在生长过程中产生乳酸引起，乳酸的积累影响乳酸菌的生长，Sobrun等研究证明，乳酸菌的产酸量和生长速度成线性相关，这与本试验的研究结果一致[15]。试验中18 h该菌到达对数期，此时OD690nm值为2.104，18 h时菌株的产酸量到达稳定，pH为3.45，该菌较李凤梅等选择的乳酸菌株生长速度快，产酸量高[16]。国家标准方法酸度的定义为以酚酞作指示剂所需的标准滴定溶液的毫升数。但在本试验中参照刘文华等研究，采用酸度计进行酸度测定，与国标法相比更方便、快捷、准确，适合实验室操作[5]。试验中采用CaCO3溶解圈法进行乳酸菌的分离，此法较普通方法简单，效果明显。因本试验中的菌种从市售酸奶获得，符合安全性原则，且生长速度快，产生有机酸速度快，符合本试验的设计。

4 结论

本试验结果表明，筛选的株菌为乳酸菌，且生长对数期为18 h，产酸速度快，产酸量高，适合作为微生物发酵饲料的菌种。

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