艾灸预处理对脑缺血再灌注损伤模型大鼠大脑皮质caspase-3蛋白表达的影响*

肖爱娇 康明非 张 毫 龚丽丽

缺血性脑血管病约占全部脑血管病的80%左右[1]，其中大多由大脑中动脉阻塞引起。目前国际上通常采用溶栓疗法[2]以恢复脑组织血流供应，但再灌注本身有时也可加重组织的功能障碍和结构损伤，即引起脑缺血再灌注损伤。因此，脑缺血再灌注损伤是缺血性脑血管病的重要病理过程。有研究认为，细胞凋亡参与了脑缺血再灌注损伤的发病过程[3]，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3在细胞凋亡中起重要调控作用，其激活后可引起细胞形态结构改变和DNA片段化[4]。研究发现，脑缺血再灌注后caspase-3的表达明显增加[5]。本课题前期预实验发现，艾灸预处理“大椎”穴能缩小大脑中动脉缺血再灌注损伤模型大鼠的脑梗死面积，减轻脑缺血再灌注损伤。本研究建立大脑中动脉栓塞（mid⁃dle cerebral artery occlusion,MCAO）缺血再灌注损伤大鼠模型，观察艾灸预处理对大脑皮质caspase-3蛋白表达的影响，以探讨艾灸预处理减轻脑缺血再灌注损伤的机制，旨在为艾灸治未病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 清洁级雄性SD大鼠21只，体质量220～280 g，购自江西中医药大学实验动物中心（合格证编号：JZDW2011-0336）。采用随机数字表法将大鼠分为假手术组（6只）、模型组（8只）和艾灸预处理组（7只）。模型组：行MCAO手术，2 h后行再灌注。假手术组：同模型组，但不插栓线。艾灸预处理组：艾灸“大椎”穴后行MCAO手术，2 h后行再灌注。3组术后均单笼饲养。纳入标准：脑缺血再灌注时神经功能缺失评分为1～3分且存活≥3 d者。本实验模型组死亡2只、艾灸预处理组死亡1只。

1.2 主要试剂及仪器 caspase-3抗体（美国Cell Signaling technology公司产品），罗丹明标记的山羊抗兔IgG（美国KPL公司产品）；CM 1950衡冷低温切片机、Leica 2000显微镜及图像分析系统（德国Leica公司）。

1.3 脑缺血再灌注损伤模型制备 参照文献[6-7]的颈内动脉线栓法并略做改良，即大鼠用3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，颈部正中切口，分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，将颈总动脉近心端、颈外动脉用丝线扎紧，颈总动脉远心端上打一活结，颈内动脉用微动脉夹夹闭，用眼科剪在颈总动脉上剪一V形小切口，用前端蘸有石蜡的鱼线（直径0.237 mm）插入颈总动脉，此时稍扎紧活结以减少或避免出血，松开微动脉夹，用镊子夹紧鱼线，沿颈内动脉直进入大脑中动脉开口处，插入深度从分叉处算起约22 mm，线栓尾端引出皮肤切口，便于拔线。假手术组同模型组，只是不插栓线。大鼠MCAO 2 h后将栓线向外拔出1 cm左右以进行再灌注。术中和术后室温控制在25℃左右。

1.4 艾灸治疗方法 将艾灸预处理组大鼠项部的毛发剪去，露出“大椎”穴作为艾灸穴位。用直径0.4 cm、长10 cm的艾条（江西中医药大学附属医院制），距穴位2 cm左右温和灸大鼠，1次/d，15 min/次，共10 d。

1.5 脑组织梗死检查 于MCAO造成脑缺血再灌注后3 d，用3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后在冰上迅速取脑，将脑置于-20℃冰箱快速冷冻20 min，以2 mm左右间隔自额向枕切成5个冠状切片，放入1%TTC染液中，置于37℃温箱中染色20 min，用甲醛溶液进行固定后拍照，计算脑梗死体积与全脑体积的百分比。

1.6 脑组织病理检查 大体观察脑组织外观后再行光镜和电镜检查。光镜检查：于MCAO造成脑缺血再灌注后3 d，用3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后仰卧位固定，用预冷的(4℃)4%多聚甲醛溶液进行心脏灌注，然后在冰上迅速取脑，分离大脑皮质，切取小块置于甲醛溶液中固定，再经石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察大脑皮质形态结构。电镜检查：将大鼠脑组织分离大脑皮质，切取1 mm3的小块置于2.5%戊二醛溶液中固定，然后放入1%锇酸后固定2 h，PBS冲洗2次，经各级乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋烘烤，进行超薄切片，经醋酸铀、枸椽酸铅双重染色等步骤，最后透射电子显微镜观察、照相。

1.7 荧光免疫组织化学法检测大脑皮质caspase-3蛋白水平 将大鼠脑组织分离大脑皮质，切取小块置于4%多聚甲醛溶液中后固定4～6 h，然后移至梯度蔗糖溶液中脱水。待组织块下沉后，于-20℃进行大脑皮质冰冻切片，厚35 μm，于切片保护液中-20℃保存。每只大鼠取6片，PBS漂洗、正常血清封闭后加入兔抗大鼠caspase-3抗体（1∶400），4℃孵育过夜，阴性对照组不加一抗，用PBS代替。PBS液清洗后，加入罗丹明标记的山羊抗兔IgG（1∶200），37℃孵育1.5 h。风干，荧光封片剂封固，荧光显微镜观察，拍照。细胞涂片上有caspase-3的部位呈红色，分别计数每张图片的caspase-3阳性细胞数。

1.8 统计学方法 计量指标以x±s表示，用SPSS 10.0进行分析，3组比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠脑组织梗死观察 大鼠脑缺血再灌注后3 d，假手术组脑组织全部染成红色，未见白色梗死灶。模型组左侧半球有白色梗死灶，右侧半球呈红色。艾灸预处理组左侧半球有白色梗死灶，但较模型组明显缩小；右侧半球呈红色，见图1。模型组脑组织梗死体积百分比明显大于假手术组和艾灸预处理组(P＜0.05)，见表1。

Table 1 The percentage of infarct size and caspase-3 positive cells after 3 days of reperfusion表1 各组脑组织梗死体积百分比及caspase-3阳性细胞数 （x±s）

2.2 大鼠脑组织病理观察 假手术组：肉眼观察可见脑组织红润，脑沟及脑回清晰。镜下见大脑皮质神经细胞排列致密、整齐；细胞结构完整、边缘清晰。模型组：肉眼观察可见左侧脑组织表面苍白、出现液化，且脑沟变浅、脑回变宽。镜下见梗死侧大脑皮质大量神经细胞变性坏死、萎缩。艾灸预处理组：肉眼观察可见左侧半球脑组织表面较苍白，脑沟及脑回较清晰。镜下见梗死侧大脑皮质神经细胞排列较致密，细胞损伤较模型组明显减轻。见图2。

2.3 电镜观察 假手术组：大脑皮质神经细胞层厚，密度大，排列整齐、紧密；细胞结构完整、边缘清晰。模型组：患侧大脑皮质细胞层变薄，细胞间隙增大，排列紊乱、疏松；细胞结构不完整，甚至有大量细胞缺失，核膜不完整，核染色质边聚。艾灸预处理组：患侧大脑皮质神经细胞层厚，密度大，排列较整齐、紧密；细胞结构完整、边缘清晰。见图3。

2.4 大鼠大脑皮质caspase-3阳性细胞数 大脑皮质中表达caspase-3蛋白的部位呈现红色，见图4。模型组大脑皮质caspase-3阳性细胞数多于假手术组和艾灸预处理组(P＜0.05)，见表1。

3 讨论

自1990年Kitagawa等[8]在沙土鼠脑缺血的实验研究中观察到缺血预处理的脑保护作用后，其他学者又陆续观察到采用其他多种预处理方式如缺氧、低氧、高温、针刺预处理等均可以引起机体对再次严重缺血的耐受。然而相对于西医利用短暂的缺血、缺氧、高温等预处理方法[9]来说，艾灸预处理具有创伤小、易于调控的优势，而且刺激温和，易于接受。

艾灸预处理即“逆灸”，属于逆针灸的一部分，是以“治未病”为主要理论基础的防病保健方法。它是通过艾灸激发经络之气，提高机体抗病能力，从而达到防止疾病的发生、减轻随后疾病的损害和保健延年的目的。研究发现艾灸预处理具有抗感染、调节机体免疫功能等作用[10]。近年有研究采用“4-动脉阻断”方法建立大鼠全脑缺血模型，观察到艾灸预处理能有效地诱导脑缺血耐受，具有神经保护作用[11]。然而，关于艾灸预处理能否减轻脑缺血再灌注损伤的报道还不多见。本研究结果显示艾灸预处理可缩小脑缺血再灌注损伤模型大鼠的脑梗死面积，减轻脑缺血再灌注损伤。

近年来研究证实，在脑缺血再灌注引起的脑组织损伤进展过程中，有许多相互关联的机制在起作用，涉及的主要病理生理过程有能量耗竭、离子紊乱、神经递质失调、酸中毒、兴奋性毒性、炎症、血管通透性改变、氧化应激和细胞凋亡等[3]。其中，细胞凋亡可能在脑缺血性脑损伤的病理过程中起重要作用。研究表明，脑缺血后神经元除坏死之外，还存在另一种死亡形式，即细胞凋亡，脑缺血再灌注可引起脑细胞凋亡[12]。本研究大脑皮质电镜观察结果提示，大鼠脑缺血再灌注后发生了细胞凋亡，而艾灸预处理具有抑制细胞凋亡的作用。但具体作用机制还不十分清楚。

近年来，caspase-3在细胞凋亡中的作用备受关注。有研究表明caspase-3在细胞凋亡中起着重要的调控作用，被认为是细胞凋亡过程中的主要执行者，可水解多种蛋白底物，包括细胞骨架蛋白、细胞周期调节蛋白、细胞信号转导蛋白、DNA修复调节因子以及细胞存活等环节中重要的蛋白，导致细胞凋亡[4]。脑缺血再灌注后大脑皮质caspase-3蛋白表达明显增加[5]。本研究结果提示，艾灸预处理可能通过降低大脑皮质caspase-3蛋白的表达而达到减轻脑缺血再灌注损伤。

综上，大脑中动脉缺血2 h后进行再灌注引起的大脑皮质caspase-3蛋白表达增加可能是造成脑缺血再灌注损伤发生机制之一，而减少大脑皮质caspase-3蛋白表达则可能是艾灸预处理“大椎”穴减轻脑缺血再灌注损伤、发挥脑保护效果的作用机制之一。

（图1~4见插页）

[1]Durukan A,Tatlisumak T.Acute ischemic stroke:overview of major experimental rodent models,pathophysiology,and therapy of focal cerebral ischemia[J].Pharmacol Biochem Behav,2007,87(1):179-197.

[2]The national institute of neurological disorders and stroke r-tPA stroke study group.Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke[J].N Engl J Med,1995,333(24):1581-1587.

[3]Kao TK,Ou YC,Liao SL,et al.Opioids modulate post-ischemic progression in a rat model of stroke[J].Neurochem Int,2008,52(6):1256-1265.

[4]Li H,Deng CQ,Chen BY,et al.Total saponins of Panax notogin⁃seng modulate the expression of caspases and attenuate apoptosis in rats following focal cerebral ischemia-reperfusion[J].J Ethnophar⁃macol,2009,121(3):412-418.

[5]Chen RX,Lv ZM,Chen MR,et al.Stroke treatment in rats with tail temperature increase by 40-min moxibustion[J].Neurosci Lett,2011,503(2):131-135.

[6]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cere⁃bral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[7] 肖爱娇,陈日新,康明非,等.热敏灸对脑缺血再灌注损伤模型大鼠SOD、MDA的影响[J].天津医药,2014,42(1):51-53.

[8]Kitagawa K,Matsumoto M,Tagaya M,et al.‘Ischemic tolerance’phenomenon found in the brain[J].Brain Res,1990,528(1):21-24.

[9]江君,杨巍巍,张楠，等.低氧预适应减轻脑中动脉阻塞所致小鼠缺血性脑损伤[J].基础医学与临床,2009,29(2):113-118.

[10]Gao M,Wu Y,Li GQ.Regulating effect of moxibustion pretreatment on Th1/Th2 imbalance of athletes during course of heavy load train⁃ing[J].Zhongguo Zhen Jiu,2011,31(3):247-251.

[11]华金双,孙忠人.艾灸预处理抗脑水肿作用研究[J].针灸临床杂志,2010,26(1):54-55.

[12]Solaroglu I,Cahill J,Tsubokawa T,et al.Granulocyte colony-stimu⁃lating factor protects the brain against experimental stroke via inhi⁃bition of apoptosis and inflammation[J].Neurol Res,2009,31(2):167-172.