高效液相色谱法同时测定癫痫清颗粒中3组分含量

张婧涵，王光函，邹桂欣

(1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847； 辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034)

癫痫清颗粒由知母、白芍、制何首乌、石菖蒲等组方，具有豁痰熄风、活血祛瘀、开窍益智的功效，临床用于痰瘀内阻的痫证，主治突然昏倒、不省人事、四肢抽搐、口吐涎沫、发作性短暂失神等。具有多酚结构的芒果苷可通过减弱Ca2+内流和氧化应激程度，减少神经元中谷氨酸引起的细胞死亡，从而达到保护神经元的作用[1]。芍药苷具有神经保护作用[2]，且前期药效物质基础研究发现，其具有延长模型动物惊厥潜伏期及睡眠时间，缩短睡眠潜伏期的作用。二苯乙烯苷是何首乌中特有的生物活性成分，其含量已成为何首乌药材的专属性指标，具有显著的脑保护功能[3]。目前单独测定芒果苷、芍药苷、二苯乙烯苷含量的方法报道较多[4-5]，但尚无同时测定三者方法的报道。笔者用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)的梯度洗脱技术，1次进样分离分析了制剂中分属3味中药的芒果苷、芍药苷、二苯乙烯苷3种组分，为复杂体系的多组分同时定量测定及其全面质量控制提供了简便、准确的方法。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱系统(四元泵，二极管阵列检测器，自动进样器)，FA1004型万分之一天平(上海精密科学仪器有限公司)；KQ-250DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。对照品芒果苷(批号为111607-200402)、芍药苷(批号为110736-201136)、二苯乙烯苷(批号为110844-201109)，均购于中国食品药品检定研究院；乙腈、醋酸为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯；癫痫清颗粒(辽宁富东制药有限公司，批号为20131101，20131102，20131103，规格为每袋 8 g)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:KromasilC18柱(250mm×4.6 mm，5μm)；流动相:乙腈(A)和(B)0.2%醋酸水溶液两相梯度洗脱，洗脱程序为0～10 min为15%A，10～20 min为15% ～25%A，20～25 min为25% ～34%A，25～30 min为 34% ～100%A；流速:1.0 mL/min；DAD 检测器，检测波长:0～9 min为 258 nm，9～17 min为230 nm，17～30 min为320 nm；柱温:25℃。

2.2 溶液制备

分别取芒果苷、芍药苷、二苯乙烯苷对照品各适量，精密称定，加稀乙醇溶解，制成各对照品贮备液。精密量取各对照品贮备液适量，置同一容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成含芒果苷、芍药苷、二苯乙烯苷质量浓度分别为0.152，0.480，0.248 g/L的混合对照品溶液，摇匀，即得对照品溶液。取本品内容物约1 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加入体积分数为50%的乙醇溶液25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，用体积分数为50%的乙醇溶液补足减失的质量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液备用，即得供试品溶液。以相同比例的处方，按样品工艺分别制备缺知母、白芍、制何首乌的阴性样品，并依法制备3种阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验:分别精密吸取对照品溶液5μL，供试品溶液及3种阴性对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图1。结果表明，阴性样品对测定无干扰，方法专属性良好。

线性关系考察:精密吸取2.2项下混合对照品溶液1，2，4，6，8，10 μL，依法进样，记录峰面积值。以对照品进样量(X，μg)为横坐标、相应的峰面积值(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程，芒果苷 Y=3 437X+85.4(r=0.999 1)，芍药苷 Y=1 215X-4.5(r=0.999 5)，二苯乙烯苷 Y=3 500X-10.0(r=0.999 5)。结果表明，芒果苷、芍药苷、二苯乙烯苷进样量分别在0.152～1.52，0.480～4.80，0.248～2.48 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

图1 高效液相色谱图

精密度试验:精密吸取同一混合对照品溶液5 μL，连续进样6次，记录峰面积。结果芒果苷、芍药苷、二苯乙烯苷精密度的 RSD分别为0.50%，1.00%，0.52%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0，2，4，8，12，20 h时进样测定峰面积。结果芒果苷、芍药苷、二苯乙烯苷的 RSD分别为2.20%，0.14%，0.64%(n=6)，表明供试品溶液在20 h内稳定。

重复性试验:取本品粉末约1 g，平行6份，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件分别进样分析，记录色谱峰面积。结果芒果苷、芍药苷、二苯乙烯苷含量的 RSD分别为2.8%，2.4%，2.9%(n=6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验:称取本品粉末约0.5 g，平行9份，精密称定，分别精密加入一定量的芒果苷、芍药苷、二苯乙烯苷的对照品溶液，依法制备供试品溶液并测定，计算回收率。结果见表1。

表1 芒果苷、芍药苷、二苯乙烯苷加样回收试验结果(n=9)

2.4 样品含量测定

取不同批号的样品约1 g，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析，计算各成分含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果(mg/袋，n=3)

3 讨论

检测波长的选择:芒果苷、芍药苷、二苯乙烯苷的紫外最大吸收波长不同，分别为258，230，320 nm，相差较大，若在某一波长条件下测定，会导致其余二者的吸收较小。因此，采用波长切换法，选择合适的出峰时间转换相应成分的波长，可以提高测定的灵敏度，且避免了出现基线漂移。

提取条件的优化:试验中采用 L9(34)正交试验法，对提取溶剂(70%乙醇、50%乙醇、甲醇)、提取时间(20，30，60 min)和提取方法(浸泡、超声、回流)进行考察，并进行方差分析。结果表明，提取溶剂及提取方法具有显著性差异，50%乙醇提取效果最好，超声和回流提取结果接近，均显著高于浸泡，而提取时间没有显著性差异。综合考虑各因素，最终确定最佳工艺为50%乙醇25mL、超声30min。

多组分同时测定的意义:由于中药作用的多途径多靶点特性，在中药新药建立质量标准时，多指标成分的质量控制比起单一指标成分定量更具科学性，建立一种能简便、快速地同时测定出多种组分的方法，将更有利于合理地控制中药质量。

参考文献：

[1]廖洪利，苏春丽，胡小兰，等.芒果苷药理研究新进展[J].药学实践杂志，2008，26(3):161.

[2]郑世存，李晓宇，欧阳兵，等.芍药苷药理作用研究新进展[J].中国药物警戒，2012，9(2):100.

[3]谢 岚.何首乌及二苯乙烯苷的研究进展[J].天津药学，2010，22(3):70.

[4]张 凤，杨 阳，孙连娜，等.生首乌与制首乌中二苯乙烯苷的含量测定与品质考察[J].中国医院药学杂志，2008，28(14):1 228.

[5]赵荣华，赵声兰，文 丹，等.何首乌不同部位二苯乙烯苷含量测定[J].云南中医学院学报，2008，31(1):7.