人脑胶质瘤中Fas、Caspase-8的表达

梁晓阳，刘洛同，明扬，陈礼刚

（泸州医学院附属医院神经外科，四川 泸州 646000）

·论著·

人脑胶质瘤中Fas、Caspase-8的表达

梁晓阳，刘洛同，明扬，陈礼刚

（泸州医学院附属医院神经外科，四川 泸州 646000）

目的探讨不同级别胶质瘤中Fas、Caspase-8的表达情况。方法针对68例经病理证实的人脑胶质瘤组织标本和15例正常对照标本，采用免疫组化SP法检测Fas、Caspase-8的表达。结果在低级别胶质瘤(LGG，Ⅰ～Ⅱ级)和高级别胶质瘤(HGG，Ⅲ～Ⅳ级)中，Fas阳性率分别为60.6%(20/33)和91.4%(32/35)，Caspase-8的阳性率分别为81.8%(27/33)和48.6%(17/35)。胶质瘤病理分级越高，Fas的阳性率越高(χ2=8.968，P=0.003<0.05)，Caspase-8的阳性率越低(χ2=8.221，P=0.004<0.05)。胶质瘤的恶性程度与Fas的表达呈正相关(rs=0.536，P<0.001)，与Caspase-8的表达呈负相关(rs=-0.348，P<0.01)。结论胶质瘤细胞可对Fas系统诱导的凋亡产生耐受，Caspase-8功能的下降与胶质瘤的发生和发展密切相关。

胶质瘤；Fas；Caspase-8；免疫组化

胶质瘤是颅内最常见的原发肿瘤，呈浸润性生长，严重威胁患者的生命健康。目前胶质瘤的发病机制还不十分清楚，有证据显示胶质瘤的发生发展与细胞凋亡密切相关[1-3]。Fas是一种死亡受体，凋亡蛋白酶-8(Caspase-8)是细胞凋亡过程中起关键作用的凋亡蛋白酶，它们介导了多种细胞的凋亡。研究表明，Fas和Caspase-8与胶质瘤的发生和发展密切相关[4]，但目前同时检测二者在胶质瘤中的表达并探讨其相互作用的研究相对较少。本研究对68例胶质瘤组织及15例正常脑组织中Fas和Caspase-8的表达进行了检测。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取泸州医学院附属医院神经外科2010年6月至2013年5月经手术证实的胶质瘤病例68例(均为初发病例，首次手术，术前均未接受放疗和化疗)，其中男性32例，女性36例，年龄4～79岁，平均49.8岁。年龄<20岁6例，20～50岁26例，>50岁36例，所有标本均经病理组织学检查确诊，参照2000年WHO神经系统肿瘤分类和分级标准：低级别(LGG，Ⅰ～Ⅱ级)33例(其中弥漫性星形胶质细胞瘤16例，纤维性星形细胞瘤10例，毛细胞星形细胞瘤2例，少突胶质细胞瘤5例)，高级别(HGG，Ⅲ～Ⅳ级)35例(其中间变性星形胶质细胞瘤16例，胶质母细胞瘤19例)。另取15例因重型颅脑外伤行内减压术切除的创伤周边相对正常的脑组织作为对照组。

1.2 主要试剂和仪器鼠抗人CD95单克隆抗体(Bioworld公司)；兔抗人Caspase-8单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；组织切片机(美国Thermo公司)；普通光学显微镜(Motic BA200型)；Image-Pro Plus软件系统(美国MEDIA CYBERNETICS公司)；电热恒温培养箱(WK891型)。

1.3 Fas、Caspase-8蛋白表达水平采用免疫组化SP法检测Fas、Caspase-8蛋白表达水平。所有标本取材后制成连续石蜡切片。胶质瘤标本进行HE染色，确定病理分级。用二甲苯及酒精脱蜡脱苯，EDTA溶液进行抗原修复，一抗孵育30 min，水洗2～3 min，加入TBS缓冲液，二抗孵育30 min，水洗2～3 min，再加入TBS缓冲液，DAB显色剂显色，苏木素复染。以TBS代替一抗作阴性对照。在切片染色均匀的肿瘤区域随机取5个高倍视野(400×)，共计500个细胞，按染色强度(Staining intensity，SI)和阳性细胞百分率(Percentage of positive cells，PP)的乘积计算免疫反应评分(Immunoreactive score，IRS)，IRS=SI×PP。SI计分：无着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。PP计分：无阳性细胞0分，阳性细胞率≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。IRS表达强度判断：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中等阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.4 统计学方法统计软件为SPSS11.5软件包，其中定性资料采用卡方检验，组间比较采用等级资料秩和检验，样本表达与胶质瘤病理分级之间的关系采用Spearman秩相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Fas在不同级别胶质瘤中的表达免疫组化染色显微镜下观察可见，Fas主要表达在细胞膜和细胞质，阳性表达为胞质或胞膜呈棕黄色或黄色(图1)。Fas在胶质瘤组织中的阳性率为76.5%(52/68)，其中在低级别胶质瘤和高级别胶质瘤中的阳性率分别为60.6%(20/33)和91.4%(32/35)，而在正常脑组织中的阳性率为20.0%(3/15)。Fas表达阳性率随胶质瘤恶性程度的增强而增高(χ2=8.968，P<0.01)，低级别胶质瘤组织Fas阳性率显著高于正常脑组织(P< 0.01)，高级别胶质瘤组织中Fas阳性率也显著高于低级别胶质瘤组织(P<0.01)和正常脑组织(P<0.001)，Fas的表达与胶质瘤的恶性程度呈正相关(rs=0.536，P<0.001，表1)。

图1 Fas在胶质瘤中的表达（免疫组化×400）

表1 Fas在不同级别胶质瘤中的表达(例)

2.2 Caspase-8在不同级别胶质瘤中的表达免疫组化染色显微镜下观察可见，Caspase-8主要表达在细胞质，阳性表达为胞质呈淡黄色或黄色(图2)。Caspase-8在胶质瘤组织中的阳性率为64.7%(44/ 68)，其中在低级别胶质瘤和高级别胶质瘤中的阳性率分别为81.8%(27/33)和48.6%(17/35)，而在正常脑组织中的表达为20.0%(3/15)。Caspase-8表达阳性率随胶质瘤病理分级的增强而降低(χ2=8.221，P< 0.01)，低级别胶质瘤组织Caspase-8阳性率显著高于高级别胶质瘤组织(P<0.01)和正常脑组织(P<0.001)，高级别胶质瘤组织与正常脑组织相比差异无统计学意义(P=0.059)，Caspase-8的表达与胶质瘤的恶性程度呈负相关(rs=-0.348，P<0.01，表2)。

图2 Caspase-8在胶质瘤中的表达（免疫组化×400）

表2 Caspase-8在胶质瘤中的表达(例)

3 讨论

近年来胶质瘤的发病率逐步增高，在成年人中的发病率约为6/10万，5年存活率为20%～30%[5-6]。目前虽然在胶质瘤的手术治疗、化学治疗、放疗等方面取得了一定的进展，基因治疗也在积极的研发中，但总的疗效仍不能令人满意，高级别胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤的中位生存期仍然徘徊在12～14个月[7]。因此，有关胶质瘤发病机制的研究始终都占有重要的地位，细胞凋亡是其中的一个研究热点问题。Fas是一种死亡受体，属于肿瘤坏死因子受体家族和神经生长因子受体家族，与其配体FasL结合后，配体化的Fas通过其死亡结构域与适配体(Fas-associated death domain protein，FADD)肽链C端的死亡结构域交连，从而使FADD募集在Fas上，FADD的N端含有死亡效应结构域，可以集聚细胞凋亡蛋白酶-8酶原，继而共同形成凋亡诱导信号复合物(Death inducing signaling complex，DISC)使Caspase-8活化，导致一系列凋亡蛋白酶活化，最终引起细胞凋亡。

既往有关胶质瘤与Fas系统的研究多局限于Fas及其配体FasL的表达以及二者之间的相互作用，对激动Fas后的下游通路研究较少。本研究着重探讨Fas的表达与其下游通路上的Caspase-8的表达之间的关系，进而研究Fas激活与细胞凋亡之间是否存在必然联系。林宁等[8]报道，Fas的表达随着肿瘤级别的增高而逐步增多，与本实验的结果一致，提示肿瘤细胞对Fas系统诱导的细胞凋亡可产生耐受或Fas系统的下游可能有导致细胞增殖的信号通路。国外有学者[9]报道Fas基因突变导致Fas表达产生多种变化，例如Fas在细胞表面表达的下调[10]、高水平的抗凋亡蛋白等。Chen等[11]研究显示在小鼠卵巢癌和肝癌模型中Fas通过下游通路JNK和c-Jun诱导肿瘤生成，提示Fas通路可能有致瘤活性，抑制Fas通路的活性而不是促进其活性可作为肿瘤治疗的研究方向。Caspase-8基因也可发生多种遗传学改变，如基因缺失、点突变、甲基化，从而阻断了凋亡蛋白酶系的级联反应，导致凋亡受阻。Liu等[12]在A431人类肿瘤细胞系中发现Caspase-8第二个死亡效应结构域区leu62缺失，导致突变的Caspase-8不能形成寡聚体与FADD相互作用，使凋亡信号通路受阻。有报道显示在人类视网膜母细胞瘤细胞系中，Caspase-8基因因甲基化而导致基因沉默，从而使Caspase-8表达下降，进而引起凋亡受阻[13]。在转移性神经母细胞瘤中Caspase-8的表达被抑制，而重建Caspase-8的表达可以抑制肿瘤的生长[14]。Yamaguchi等[15]利用腺病毒载体在肝癌HCC细胞系中提高Caspase-8的表达，发现提高Caspase-8的表达可以下调抗凋亡蛋白如Bcl-xL的表达，促进细胞色素C的释放，通过线粒体途径诱导细胞凋亡，这些研究结果都表明Caspase-8功能的下降与肿瘤的发生和发展密切相关。

综上所述，肿瘤细胞可对Fas/FasL系统诱导的凋亡产生耐受，Caspase-8基因的突变可导致其功能的下降或缺失，研究调控Caspase-8的相关机制，探讨选择性调节Fas/Fas L系统诱导细胞凋亡或增殖的机制以及与其他信号通路之间的关系将是未来研究的热点问题。随着分子生物学的飞速发展，必将为胶质瘤的治疗提供特异性的靶点，大幅提高胶质瘤的治疗效果。

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Expression of Fas and Caspase-8 in human glioma.

LIANG Xiao-yang,LIU Luo-tong,MING Yang,CHEN Li-gang. Department of Neurosurgery,Affiliated Hospital to Luzhou Medical College,Luzhou 646000,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo explore the expression and significance of Fas and Caspase-8 in human gliomas.MethodsThe expressions of Fas and Caspase-8 were detected by SP immunohistochemistry in 68 human gliomas specimens and 15 normal brain tissues,respectively.ResultsThe positive rates of Fas in low grade gliomas(LGG,ⅠandⅡ)and high grade gliomas(HGG,ⅢandⅣ)were 60.6%(20/33)and 91.4%(32/35),respectively.The positive rates of Caspase-8 were 81.8%(27/33)and 48.6%(17/35)in the LGG and HGG groups,respectively.The expression of Fas was associated with the clinical stage(P<0.05).The expression of Fas was positively correlated with the glioma grade(P<0.001).However,the expression of Caspase-8 was negatively correlated with the glioma grade P< 0.01).ConclusionGliomas cells may have the tolerance to the apoptosis induced by Fas,the decrease in the function of Caspase-8 was closely related to the occurrence and development of glioma.

Glioma;Fas;Caspase-8;Immunohistochemistry

R730.264

A

1003—6350(2014)07—0947—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.07.0368

2013-10-29)

陈礼刚。E-mail：chengligang.cool@163.com