葡萄糖脑苷脂酶基因多态性与帕金森病的相关性研究

司君增，魏丽萍，郭秀玲，宋方禹，亓勤德

（莱芜市人民医院神经内科，山东 莱芜 271199）

·论著·

葡萄糖脑苷脂酶基因多态性与帕金森病的相关性研究

司君增，魏丽萍，郭秀玲，宋方禹，亓勤德

（莱芜市人民医院神经内科，山东 莱芜 271199）

目的研究中国山东人群帕金森病患者的葡萄糖脑苷脂酶(Glucocerebrosidase，GBA)基因N370S、V394L和L444P突变位点多态性，探讨GBA基因突变与帕金森病的相关性。方法应用PCR产物直接DNA测序法对60例帕金森病患者及60例正常对照组的9、10号外显子进行检测，然后进行测序对比分析。结果测序结果显示帕金森病患者和正常对照组的GBA基因外显子9和外显子10核苷酸序列完全一致，未发现突变点。结论该研究不支持GBA基因N370S、V394L和L444P突变位点是中国山东人群帕金森病的危险因素。

帕金森病；葡萄糖脑苷脂酶基因；基因突变

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种中老年人常见的运动障碍疾病。由于该病具有较强的致残性，严重影响了患者的正常工作及生活，给患者家属及社会带来了沉重的负担，已成为社会关注的焦点之一[1]。研究易感候选基因是探索PD这种复杂疾病的关键步骤。近年来，GBA基因成为研究的热点，而且，不同种族不同区域人群有遗传异质性，之前的研究结果不一[2-3]。重要的是，中国人群PD患者基数庞大，中国大陆山东人群尚未有类似报道，说明开展对山东人群的GBA基因与PD相关性的深入研究，具有重要的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料病例组系2011年9月至2013年7月山东省莱芜市人民医院、山东大学齐鲁医院、山东省立医院神经内科门诊及住院的帕金森病患者，帕金森病的诊断参照英国脑库的诊断标准。对照组系莱芜市人民医院门诊健康体检人员，排查锥体外系及其他神经系统变性疾病。病例组及对照组各60例，均为山东地区汉族，性别及年龄分布两组间差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 提取基因组DNA抽取研究对象外周静脉血5 ml，用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝。常规酚/氯仿法提取基因组DNA。

1.2.2 聚合酶链扩增反应(PCR)引物合成真、假基因具有高度同源性，首先将真假基因区分开，在此基础上分别扩增单个外显子；参照相关文献设计引物[2]，由上海生工公司合成。引物序列见表1(均为5'-3'方向)。

表1 GBA基因PCR引物序列

1.2.3 PCR反应条件94℃预变性5 min，94℃变性5 min，退火45 s(外显子8～11、外显子9、外显子10的退火温度分别为40℃、50℃、50℃)，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃终延伸7 min。1.5%琼脂糖凝胶检验PCR扩增产物。反应体系总体积25 μl，包括ddH2O、10×PCR buffer、5 mmol/L的4种dNTP、5 mmol/L的MgCl2、10 μmol/L引物A(正向)、10 μmol/L引物A(反向)、模板DNA、TaqDNA聚合酶(5 U/μl)。

1.2.4 序列测定从琼脂糖凝胶中回收扩增外显子9、外显子10的PCR产物，纯化产物测序委托上海生工公司和北京天根公司完成，测序结果与Gene-Bank提供的序列用Blast软件进行比对；根据比对结果判别基因有无突变。

2 结果

2.1 琼脂糖凝胶电泳结果通过PCR扩增反应，GBA基因第8～11外显子扩增成功(扩增片段长度1 682 bp，见图1)，将其产物纯化后作为模板扩增GBA基因外显子9(扩增片段长度362 bp，见图2)和外显子10(扩增片段长度329 bp，见图3)也扩增成功，琼脂糖凝胶电泳结果显示为相应特异长度的单一条带，部分电泳图如下：

图1 8～11号外显子条带（1 682 bp）

图2 9号外显子条带（362 bp）

图3 10号外显子条带（329 bp）

2.2 DNA直接测序结果测序结果经序列比对后PD病例组和对照组均未发现GBA基因9号外显子N370S(见图4)突变和V394L(见图5)突变，也未发现10号外显子L444P(见图6)突变。部分测序峰图如下：

图4 N370S突变：图中68位A→G

图5 V394L突变：图中139位G→T

图6 L444P突变：图中118位T→C

3 讨论

葡萄糖脑苷脂酶(GBA)基因定位于人染色体1q21。基因全长为7.6 kb，含11个外显子；假基因位于下游16 kb。在同源区内，96%的核苷酸是一致的[4]。因此研究GBA基因，尤其在研究GBA基因的多态性时，前提必须将真、假基因区分开，否则课题研究将导致一系列的误差，本文根据真假基因序列的差异而设计的特异引物首先扩增真基因的外显子8～11，此引物与假基因不能结合从而不能扩增假基因，从而将此片段的真假基因区分开，然后根据每个外显子设计相应引物扩增单个外显子[2]。

GBA基因编码由536个氨基酸组成的葡萄糖脑苷脂酶，该酶将葡萄糖脑苷脂水解为神经酰胺被机体再利用。GBA基因突变导致葡萄糖脑苷脂酶活性降低，不能将葡萄糖脑苷脂水解为神经酰胺，释放的葡糖脑苷脂就会被网状内皮系统(脾、肝、骨髓)中的巨噬细胞吞入并储存于其溶酶体中形成十分独特的微管状结构，进而干扰正常细胞凋亡[5]。

戈谢病(Gaucher's disease)是一种常染色体隐形遗传疾病，称葡萄糖神经酰胺贮积病，一般认为其病因源于葡萄糖脑苷脂酶(GBA)基因突变导致该酶活性降低，造成葡萄糖脑苷脂酶在网状内皮组织巨噬细胞中的大量沉积，出现了特征表现的戈谢细胞。目前已经报道的GBA基因突变有200多种，其中常见的有N370S、84GG、L444P，V394L，研究发现在犹太民族戈谢患者中N370S突变占到78%，而在非犹太民族戈谢病患者中最常见的突变则是L444P(36%)，其次是N370S(23%)[6-7]，因此本研究选取了以上突变频率最高的三个位点N370S、V394L和L444P进行研究。

我们的研究结果发现60例帕金森病患者和60例正常对照的GBA基因的外显子9、10的核苷酸序列完全一致，未发现基因突变，这与焦玲等[8]对中国贵州人群的研究报道结果相一致。该研究也未发现V394L和L444P突变，但在挪威、巴西、以色列、意大利、台湾、新加坡华裔人群等PD患者的研究中却发现了这两个位点的突变[9-15]。这种差异可能是因为我们的研究样本量相对较小，或者是地区、种族差异引起。

国外学者研究以色列德系犹太人帕金森病患者的GBA基因突变，N370S是最常见突变位点；挪威学者对311例PD患者GBA基因进行筛查，结果发现7例有基因突变的患者中有4例为N370S突变；然而台湾及新加坡华裔人群PD患者的GBA基因测序分析未发现N370S突变[12]。因此，我们推测N370S位点不是亚洲人群的突变热点，而是欧洲、美洲等发达国家PD患者GBA基因的突变热点，同时也表明GBA基因N370S多态性可能因人群种族和地区不同而存在差异性。

尽管本研究我们未发现PD患者及正常对照组的葡萄糖脑苷脂酶基因突变，但不能就此排除在帕金森病的发病机制中，GBA基因突变参与发病的可能性，在以后的研究中，我们将增大PD患者样本量及基因位点的监测，为进一步阐明PD的发病机制提供宝贵的基础资料。

[1]Levy G,Tang MX,Louis ED,et al.The association of incident dementia with mortality in PD[J].Neurology,2002,59(11):1708-1713.

[2]Bonifati V,Rizzu P,Squitieri F,et al.DJ-1(PARK7),a novel gene for autosomal recessive,early onset parkinsonism[J].Neurol Sci, 2003,24(3):159-160.

[3]Valente EM,Abou-Sleiman PM,Caputo V,et al.Hereditary early-onset Parkinson's disease caused by mutations in PINK 1[J]. Science,2004,304(5674):1158-1160.

[4]Bembi B,Zambito Marsala S,Sidransky E,et al.Gaucher's disease with Parkinson's disease:clinical and pathological aspects[J].Neurology,2003,61(1):99-101.

[5]Whaley NR,Uitti RJ,Dickson DW,et al.Clinical and pathologic features of families with LRRK2-associated Parkinson's disease[J]. J Neural Transm Suppl,2006,70:221-229.

[6]Guggenbuhl P,Grosbois B,Chale's G.Gaucher disease[J].Joint Bone Spine,2008,75:116-124.

[7]Beutler E.Gaucher disease:Multiple lessons from a single gene disorder[J].Acta Paediatr Suppl,2006,95:103-109.

[8]焦玲,司君增,楚兰.葡糖糖脑苷脂酶基因多态性与帕金森病的相关性[J].江苏医药,2010,36(5):518-520.

[9]Prestel J,Sharma M,Leitner P,et al.PARK11 is not linked with Parkinson's disease in European families[J].Eur J Hum Genet,2005, 13(2):193-197

[10]Maraganore DM,de Andrade M,Lesnick TG,et al.High-resolution whole-genome association study of Parkinson disease[J].Am J Hum Genet,2005,77(5):685-693.

[11]Pankratz N,Foroud T.Genetics of Parkinson disease[J].Neuro Rx, 2004,1(2):235-242.

[12]Heutink P.PINK-1 and DJ-1-new genes for autosomal recessive Parkinson's disease[J].J Neural Transm Suppl,2006,70:215-219.

[13]Kubo S,Hattori N,Mizuno Y.Recessive Parkinson's disease[J]. Mov Disord,2006,21(7):885-893.

[14]Kubo S,Hattori N,Mizuno Y.Recessive Parkinson's disease[J]. Mov Disord,2006,21(7):885-893.

[15]Prestel J,Sharma M,Leitner P,et al.PARK11 is not linked with Parkinson's disease in European families[J].Eur J Hum Genet,2005, 13(2):193-197.

Association between glucocerebrosidase genetic polymorphisms and Parkinson's disease.

SI Jun-zeng,WEI Li-Ping,GUO Xiu-ling,SONG Fang-yu,QI Qin-de.Department of Neurology,Laiwu People's Hospital,Laiwu 271199, Shandong,CHINA

ObjectiveTo study the polymorphisms of Glucocerebrosidase(GBA)gene mutation sites (N370S,V394L and L444P)in patients with Parkinson's disease in Shandong province of China,and to explore the relationship between GBA gene and Parkinson's disease(PD).MethodsExon 9 and exon 10 of GBA gene were amplified the in 60 PD patients and 60 normal controls by polymerase chain reaction(PCR).PCR products were analyzed by direct DNA sequencing.BLAST was used for sequences analysis.ResultsThe sequence results demonstrated that the nucleotide sequences of exon 9 and exon 10 of GBA gene in the patients of Parkinson's disease and normal controls were the same,with no mutation found.ConclusionThe GBA gene mutation sites(N370S,V394L and L444P)may not be risk factors for PD in Chinese Shandong population.

Parkinson's disease;Glucocerebrosidase gene;Gene mutation

R742.5

A

1003—6350（2014）07—0944—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.07.0367

2013-10-25)

莱芜市人民医院科研立项课题（编号：yylx2013022）

司君增。E-mail：sjz2835@163.com