高血压病合并心房颤动患者ACE多态性与TGFβ1/CTGF的关系

林宪如，任永强，史 悦，吴 娜，马 颖，王正忠，王海洋

(青岛市立医院心内科，山东 青岛 266011)

高血压病合并心房颤动患者ACE多态性与TGFβ1/CTGF的关系

林宪如，任永强，史 悦，吴 娜，马 颖，王正忠，王海洋

(青岛市立医院心内科，山东 青岛 266011)

目的探讨高血压病(EH)合并心房颤动(AF)患者血管紧张素转换酶(ACE)基因插入/缺失(I/D)多态性与转化生长因子β1(TGFβ1)、结缔组织生长因子(CTGF)的关系。方法选择75例EH合并AF患者分为阵发性AF组(EH+pAF，44例)和慢性AF组(EH+cAF，31例)，记录一般临床资料及行超声心动图检查，用ELISA法测定血清TGFβ1、CTGF，用PCR方法检测ACE基因插入/缺失(I/D)多态性，并与EH且为窦性心律(SR)组(EH+SR，37例)及健康对照者(NC，36例)进行比较；比较EH+AF组不同基因型间TGFβ1与CTGF的血清浓度。结果EH+ cAF组和EH+pAF组血清TGFβ1及CTGF水平均显著高于EH+SR组和NC组(P＜0.01)；EH+AF组与EH+SR组、NC组ACE I/D多态性缺失纯合型(DD型)、杂合子(DI型)、插入纯合型(II型)基因型频率比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，但D等位基因分布频率在EH+AF组中较EH+SR组和NC组明显增加(P＜0.05)；EH+AF组不同基因型之间TGFβ1及CTGF浓度比较发现，DD基因型TGFβ1浓度显著高于DI型(P＜0.01)和II型(P＜0.01)，DD基因型CTGF浓度明显高于II型(P＜0.05)。结论D等位基因可能是高血压病合并心房颤动的易患基因；房颤患者ACE DD基因型TGFβ1和CTGF水平明显升高，藉此可引起心房肌纤维化及心房重构，导致房颤的发生和发展。

高血压病；心房颤动；血管紧张素转换酶基因插入/缺失多态性；转化生长因子β1；结缔组织生长因子

临床流行病学及荟萃分析发现，孤立性或家族性心房颤动(Atrial fibrillation，AF，简称房颤)与血管紧张素转换酶(ACE)多态性有关[1-2]，其中，房颤与ACE基因插入/缺失(I/D)多态性研究最多[3]。然而，高血压病导致的房颤是否与ACE I/D多态性有关则目前报道较少。本研究分析高血压病合并房颤与ACE I/D基因多态性的关系，并探讨不同基因型与转换生长因子(TGFβ1)及结缔组织生长因子(CTGF)之间的关系，旨在分子水平上探讨肾素-血管紧张素系统与房颤发生的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年3～11月在我院心内科住院的高血压病合并房颤患者75例，其中阵发性房颤(EH+pAF组)44例、慢性房颤(EH+cAF组，房颤持续≥6个月)31例，房颤的诊断均经心电图或Holter证实。选择同期住院的高血压病合并窦性心律(Sinus rhythm，SR)患者37例(EH+SR组)及来自我院查体中心的健康人群36例(NC组)作为对照。所有高血压病患者记录及收集临床资料，行心脏彩超检查。

1.2 排除标准 入选患者排除继发性高血压、急性冠脉综合征、陈旧性心肌梗死、瓣膜性心脏病、心肌病、肺心病、先心病及其他各种类型心律失常。80岁以上、3个月内服用RAS抑制剂(ARB、ACEI类药物)、脑卒中、肾脏受损、进行过大手术、近期正在服用抗炎药物或Ⅰ、Ⅲ类抗心律失常药物者、两周内有任何感染史及恶性肿瘤、肝脏与肺纤维化的患者亦排除在外。

1.3 标本采集 入选研究对象清晨采取空腹静脉血5 ml，置于干净的凝胶真空管内，室温下凝固30 min，以3 000 r/min离心10 min，取上清液立即分装，置-80℃冰箱保存，待测TGFβ1和CTGF。分离出的血细胞同时置于-80℃冰箱保存，用于提取DNA。

1.4 检测方法

1.4.1 TGFβ1和CTGF检测 取一定量样本行预实验确定待测因子的最佳稀释比例，然后统一采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)测定血清TGFβ1和CTGF含量。ELISA试剂盒购于上海逸晗生物科技有限公司(LOT：20121101A)，严格按照试剂盒说明进行操作，建立标准曲线，设立空白对照、阴性对照，控制板内变异系数＜10%，板间变异系数＜5%。

1.4.2 ACE基因型鉴定 将研究对象分离出的血细胞悬液解冻，按GENEray公司血液基因组DNA抽提试剂盒说明提取外周血DNA，扩增ACE基因片段PCR引物序列参照Rigat设计[4]：上游引物为CTGG AGACCACT CCCA TCCT TTCT，下游引物为GATG TGGC CATC ACAT TCGT AGAT。PCR条件为起始95℃预变性3 min，继之95℃变性10 s，59℃退火20 s，72℃延伸20 s，共30个循环；再以72℃延伸5 min，最终设定温度为16℃，以琼脂糖凝胶电泳判定基因型，同时选取PCR产物样本测序鉴定。

1.5 统计学方法 应用SPSS18.0统计软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差()表示，组间比较应用独立样本t检验，多组比较使用方差分析，两两比较用q检验。计数资料应用交叉表χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 高血压病合并房颤组与高血压病窦性心律组间临床指标比较 EH+cAF组、EH+pAF组及EH+ SR组患者的性别、年龄、体重指数、SBP、DBP、血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、室间隔厚度、左室后壁厚度及射血分数比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。然而，EH+cAF组患者左房内径[(44.3±6.9)mm]明显高于EH+pAF组[(37.4±5.0)mm](t=4.732，P＜0.005)和EH+SR组患者[(35.0±3.2)mm](t=6.888，P＜0.001)，而EH+pAF组左房内径与EH+SR组差异无统计学意义；EH+cAF组左室内径[(49.0±6.4)mm]亦明显高于EH+SR组[(46.1±3.8)mm](t=2.286，P＜0.05)，而EH+pAF组左室内径[(46.7±4.2)mm]与EH+SR组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 各组血清TGFβ1与CTGF水平比较 EH+ cAF组和EH+pAF组患者血清TGFβ1水平均明显高于EH+SR组(分别为t=3.890，P＜0.001和t=2.293，P＜0.05)及NC组(分别为t=4.257，P＜0.001和t=2.762，P＜0.005)；血清CTGF水平在EH+cAF组和EH+pAF组患者亦均明显高于EH+SR组(分别为t=96.078，P＜0.001和 t=32.807，P＜0.001)及 NC组(分别为 t= 198.609，P＜0.001和t=38.842，P＜0.001)，但EH+cAF组与EH+pAF组之间差异无统计学意义，见表1。

表1 各组TGFβ1与CTGF水平的比较()

表1 各组TGFβ1与CTGF水平的比较()

注：与EH+SR组和NC组比较，aP＜0.001，bP＜0.05。

EH+cAF组EH+pAF组EH+SR组NC组31 44 37 36 49.6±29.5a39.5±31.1b28.3±8.6 25.2±13.0 8162.6±206.0a7867.9±1295.3a1135.4±378.5 261.8±87.6

2.3 各组ACEI/D基因多态性分布频率比较 EH+cAF组与EH+pAF组患者DD、II、DI基因型与EH+SR组及NC组患者相应基因型分布频率差异无统计学意义；将EH+cAF组与EH+pAF组患者合并为EH+AF组，虽未发现合并后的EH+AF组DD、DI、II基因型与EH+SR组及NC组患者相应基因型分布频率差异无统计学意义(P＞0.05)，但D等位基因分布频率(56.7%)明显高于EH+SR组(41.9%)和NC组(38.9%)(P＜0.05)，见表2。

表2 各组ACE I/D基因型与等位基因分布比较[例(%)]

2.4 EH+AF组患者不同基因型TGFβ1与CTGF水平比较 经单因素方差分析，EH+AF组患者ACE I/D不同基因型TGFβ1与CTGF水平差异有统计学意义。进一步两两比较发现，DD基因型TGFβ1水平明显高于DI型(t=2.571，P＜0.05)和II型(t=2.840，P＜0.01)，而DI型与II型间TGFβ1比较差异无统计学意义(P＞0.05)。DD基因型CTGF水平亦显著高于DI型(t=2.109，P＜0.05)和II型(t=5.069，P＜0.001)，而DI型与II型间比较CTGF水平差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表3 高血压病合并房颤组不同ACE I/D基因型间TGFβ1、CTGF的比较()

表3 高血压病合并房颤组不同ACE I/D基因型间TGFβ1、CTGF的比较()

注：与DD型比较，aP＜0.05；bP＜0.01。

基因型DD型DI型II型例数27 31 17 TGFβ1(ng/ml) 54.03±26.92 37.81±11.79a32.43±24.08bCTGF(ng/ml) 8.25±0.19 8.03±0.10a7.99±0.69b

3 讨论

心房颤动是临床上常见的心律失常，许多临床研究表明，高血压是导致心房颤动的重要危险因素[5-6]，在一项对医院就诊患者心房颤动的归因调查中，高血压病为最常见疾病，达40.3%，远高于其他心血管疾病[7]。Go等[8]研究也发现，高血压病者伴发心房颤动是血压正常者的1.9倍。近些年来，心房颤动与ACE基因多态性的关系受到重视，有报道提示ACE多态性与心房颤动有关，DD型者发生房颤的风险明显高于DI型和II型[3，9]，国内一项小规模的临床研究虽未支持这一结论，但也发现房颤组D等位基因明显高于对照组[10]。高血压病合并的房颤是否与ACE I/D多态性有关，目前报道较少，常慧颖等[11]对非家族性和非孤立性心房颤动与ACE I/D基因多态性的关系进行了观察，其结果与国外报道相似，研究对象中包含了少量高血压患者，但并非专门针对高血压病合并房颤的患者进行研究；另一项研究发现在45岁以下高血压病合并房颤患者中D等位基因频率(60%)高于单纯高血压组患者(41.7%)，但由于纳入病例数极少而差异无统计学意义[12]。我们在研究中发现高血压病合并房颤患者DD型高于窦性心律的高血压病患者及正常对照人群，其结果差异无统计学意义，可能与入选患者病例较少有关，但D等位基因明显高于另外两组，提示ACE I/D基因多态性与高血压病患者的房颤发生有关。

心房纤维化是房颤发生和发展的病理基础。TGFβ1是重要的促纤维化细胞因子，可调节细胞外基质如胶原、蛋白多糖及纤维结合蛋白的合成，Verheule等[13]在转基因大鼠实验中曾证实，TGFβ1的过度表达可导致心房纤维化并使房颤易感性增强，但这些大鼠的心室并不出现纤维化改变，表明TGFβ1具有选择性促心房纤维化作用。先前有研究表明，高血压病患者ACE DD基因型血清前胶原Ⅲ显著高于II和DI基因型，且D等位基因对左室肥厚和心肌纤维化的发生发展有着促进作用[14]。我们在研究中发现，高血压病合并房颤组ACE DD基因型血清TGFβ1水平明显高于DI及Ⅱ基因型，由此推断ACE DD基因型可能是通过促进心房肌表达TGFβ1增加、从而促进心房肌纤维化而成为房颤的危险因素。ACE为二肽羧基肽酶，ACEI/D基因多态性在很大程度上决定了ACE水平，后者可促进AngⅡ的生成和释放增加。AngⅡ通过作用于心肌细胞上的AT-1受体使TGFβ1表达增强，后者可通过刺激其下游调节物CTGF的分泌、促进心房肌组织纤维化形成。Darbar等[15]还发现，无论是高血压合并房颤还是孤立性房颤患者，ACE DD型和DI型者抗心律失常药治疗的失败率均明显高于II型(P＜0.005)。对于高血压病合并心房颤动患者，针对ACE基因多态性进行干预及优化抗心律失常药物，可望在基因水平上为房颤的治疗提供新的视角。

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Correlation between angiotensin converting enzyme gene polymorphisms and TGFβ1/CTGF in hypertensivepatients with atrial fibrillation.

LIN Xian-ru,REN Yong-qiang,SHI Yue,WU Na,MA Ying,WANG Zheng-zhong,WANG Hai-yang.

Department of Cardiology,Qingdao Municipal Hospital,Qingdao 266011,Shandong,CHINA

ObjectiveTo explore the relationship between the polymorphisms of angiotensin converting enzyme(ACE)insertion/deletion(I/D)gene and transforming growth factor β1(TGFβ1)/connective tissue growth factor (CTGF)in patients with essential hypertension(EH)and atrial fibrillation(AF).MethodsSeventy-five EH patients with documented AF were divided into the paroxysmal AF group(EH+pAF group,n=44)or the chronic AF group (EH+cAF group,n=31),and 37 EH patients with sinus rhythm(SR)were selected into the EH+SR group.All clinical data including blood pressure,lipids,glucose and atrial diameter measured from ultrasonic cardiogram were recorded. Thirty-six healthy subjects from the medical examination center were assigned to normal controls(NC group).The serum TGF β1,CTGF were measured by ELISA method,and the genotypes of ACE(I/D)gene were identified by polymerase chain reaction(PCR)and PCR restricted fragment length polymorphism assay.TGF β1/CTGF concentration and ACE I/D genotypes were compared within different groups.ResultsThe serum TGF β1and CTGF levels of EH+ pAF and EH+cAF groups were significantly higher than those of EH+SR and NC group(P＜0.001,respectively).In spite of no difference of ACE I/D genotypes between the four groups,allele D genotype frequency in EH+AF group was significantly higher than that in EH+SR and NC groups(P＜0.05).Among the patients in EH+AF group,the serum TGF β1concentration was significantly higher in patients with DD genotype than in those with ID andⅡgenotypes (P＜0.05 and P＜0.01,respectively),and the serum CTGF level was also markedly higher in patients with DD genotype than in those with ID andⅡgenotypes(P＜0.05).ConclusionThe allele D may be the risk factor for AF in EH patients.The serum TGF β1/CTGF levels were markedly elevated in AF patients with DD genotype of ACE,which may cause atrial fibrosis and atrial remodeling,resulting in the occurrence and development of atrial fibrillation.

Hypertension;Atrial fibrillation;Angiotensin converting enzyme gene I/D polymorphisms;Transforming growth factor β1;Connective tissue growth factor

R544.1

A

1003—6350（2014）24—3610—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.24.1409

2014-06-14)

任永强。E-mail：renyongqiang1981@sina.com