苦参碱对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用研究

吴 洋，王 洋，马学琴

(1.宁夏医科大学 药学院，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学 回药现代化工程技术研究中心，宁夏 银川 750004；3.银川市口腔医院，宁夏 银川 750004)



苦参碱对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用研究

吴 洋1,2，王 洋3，马学琴1,2

(1.宁夏医科大学 药学院，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学 回药现代化工程技术研究中心，宁夏 银川 750004；3.银川市口腔医院，宁夏 银川 750004)

目的：研究苦参碱对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用并初步探讨其机制。方法：采用♂昆明小鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性对照(硫普罗宁30 mg/kg)组、苦参碱高、中、低剂量(80 mg/kg、40 mg/kg和20 mg/kg)组，分别灌胃给药6天，于第6天末次给药2h后除正常对照组外，其余各组一次性灌胃给予50%乙醇(5 g/kg)。乙醇处理12h后测定血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)的活性及肝脏组织匀浆丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽还原酶(GSH-px)的含量，并进行肝组织病理学切片检查及Ridit分析。结果：与模型组比较，苦参碱各剂量组血清AST、ALT活力和肝组织MDA含量显著降低(P<0.05)；肝组织SOD、GSH-Px 活力均升高(P<0.05)；苦参碱高、中剂量组R值显著于模型组(P<0.05)。结论：苦参碱对小鼠急性酒精性肝损伤具有保护作用，其保护作用可能与抗氧化应激相关。

苦参碱；酒精；急性肝损伤；谷草转氨酶；谷丙转氨酶；氧化应激

酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是长期过度饮酒导致的肝脏疾病，是肝硬化的最主要病因之一[1]。随着近年来我国饮酒人群不断增加，ALD的发病率和死亡率也逐年增高，已成为继病毒性肝炎之后的第二大肝病[2]。目前，ALD的治疗仍然是以戒酒为主，尚无特效药物，且支持治疗作用有限。寻找预防和治疗酒精性肝损伤的药物已成为国内外研究的热点之一。苦参碱(matrine)是从宁夏特色回药材苦豆子(SophoraalopecurodiesL)中提取的主要生物碱之一，具有诸多药理作用。研究表明，苦参碱对内毒素和缺血再灌注致肝损伤具有保护作用[3]。酒精可参与肝细胞中氧化应激反应，其在肝中的过量代谢可产生大量自由基，促进肝细胞的脂肪变性、坏死和炎细胞浸润从而导致肝损伤[4]。酒精所致肝损伤的机制与乙醇及其代谢产物对肝细胞的氧化损伤和降低抗氧化物水平有关[5-6]。本研究旨在观察苦参碱对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用及初步作用机制，为其防治急性酒精性肝损伤提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

清洁级♂昆明种小鼠共60只，体重18～22g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(宁)2011-0003。

1.2 试剂

苦参碱(宁夏紫荆花药业有限公司，纯度99.8%，批号90110301)；硫普罗宁( 河南省新谊药业股份有限公司，批号100909)；50%乙醇(分析纯，天津基准化学试剂有限公司，批号20101020)；谷丙转氨酶(ALT) 试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20110316)；谷草转氨酶(AST) 试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20110309)；丙二醛(MDA) 试剂(南京建成生物工程研究所，批号20110309)；超氧化物歧化酶(SOD) 试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20110315); 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20110307); 考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20110303);冰醋酸(北京化工厂，批号20081018)。

1.3 仪器

VIS-7220N 可见分光光度仪(北京中西远大科技有限公司)；低温超速离心机(日本东京Hongo . BUNKYO-KU)；SHHW21三用电热恒温水浴箱(北京长远实验设备厂)；MERRLERAE240型电子分析天平(梅特勒-托利仪器上海有限公司)。

2 方法

2.1 造模及给药

60只♂昆明小鼠，适应性饲养1周后，随机分为正常对照组、模型组、阳性对照(硫普罗宁30 mg/kg)组、苦参碱高、中、低剂量(80 mg/kg、40 mg/kg和20 mg/kg)组。正常组和模型组给予蒸馏水，阳性药物组和苦参碱各剂量组给予对应剂量药物灌胃，每天灌胃1次，连续6天。根据文献[7]，于第6天灌胃2h后，模型组、阳性对照组及苦参碱各剂量组一次性灌胃给予体积分数为50%乙醇(分析纯，以蒸馏水稀释)，灌胃量为12.5mL/kg，折合乙醇剂量为5g/kg[乙醇剂量(g/kg)=乙醇密度(0.8g/mL)×乙醇体积(12.5mL/kg)×乙醇浓度]，正常组给予蒸馏水灌胃。

2.2 样本采集及指标检测

小鼠于末次给药后禁食12 h，自由饮水。采用眼球后静脉丛取血法获得血标本后于4℃静置2 h，1 500 r /min 离心10 min，取上清液测定ALT、AST 活性;取肝组织约0.3g，剪碎后按1∶9比例加入生理盐水，冰浴中制备肝脏组织匀浆，测定肝匀浆中MDA 含量以及SOD、GSH-Px 活性。同时取肝左叶距边缘0.5cm 处的一小块肝组织，用10% 甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，行HE 染色，光镜下观察肝组织脂肪变性程度和炎症、坏死情况。依据中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组《酒精性肝病诊疗指南：2010年1月(修订)》进行肝脏脂肪变性评分分级[8]。按肝细胞脂肪变性占所获取肝组织标本量的范围，分为4度(F0-4)：F0:<5%的脂肪细胞脂肪变性；F1:5%～30%的肝细胞脂肪变性；F2:31%～50%的肝细胞脂肪性变；F3:51%～75%的肝细胞脂肪变性；F4:>75%的肝细胞脂肪变性。

2.3 统计学处理

3 结果

3.1 苦参碱对急性酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST 活性的影响

模型组血清ALT、AST 活性较正常对照组明显增加(P<0.01)，苦参碱可明显降低模型小鼠血清ALT、AST 活性(P< 0.05，P<0.01) 。具体见表1。

表1 苦参碱对急性酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响 (n=10,±s)

注：与正常对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01。

3.2 苦参碱对小鼠急性酒精性肝损伤肝组织MDA、SOD、GSH-Px活性的影响

模型组肝组织MDA含量较正常对照组明显增加(P<0.01)，SOD 和GSH-PX 活性较正常对照组显著降低(P<0.01)，苦参碱各剂量组可明显降低模型小鼠肝组织MDA含量(P<0.01)，中、高剂量组可明显提高模型小鼠肝组织SOD、GSH-Px 活性(P<0.01)。见表2。

表2 苦参碱对小鼠急性酒精性肝损伤肝组织MDA、SOD、GSH-Px活性的影响 (n=10,±s)

注：与正常对照组比较，**P<0.01;与模型组比较，##P<0.01。

3.3 苦参碱对小鼠急性酒精性肝损伤肝组织病理变化的影响

光镜下，正常对照组可见肝小叶及肝细胞结构完整，肝细胞条索围绕中央静脉呈放射状排列，界限清晰，病理脂肪变为F0度。模型组肝小叶结构模糊，肝索排列紊乱，肝细胞肿胀明显，胞浆透明，胞质疏松，可见圆形脂肪空泡几乎占据所有肝组织及炎细胞浸润，局部细胞核溶解坏死，病理脂肪变以F4度为主。苦参碱低剂量组肝小叶结构尚存在，其中可见局部脂肪空泡，肝细胞肿胀减轻，脂肪变以F2和F3度为主。苦参碱中、高剂量组小鼠肝小叶基本正常，肝窦轮廓整齐，细胞分界清晰，肝细胞无明显空泡及疏松，少见炎细胞浸润，脂肪变为F1和F2度。由于病理多分类变量按F0-F5度由轻到重排列，Ridit平均值低于0.05，表示病理变化较轻。统计结果显示苦参碱高、中剂量组小鼠肝损伤程度较模型组均有所减轻，差异有统计学意义(P<0.05)，提示苦参碱可以减轻乙醇致小鼠急性肝损伤。见图1和表3。

图1 苦参碱对小鼠急性酒精性肝损伤肝组织病理变化的影响(×40)

组别剂量(mg/kg)数量脂肪变积分F0(<0．5%)F1(5%～30%)F2(31%～50%)F3(51%～75%)F4(>75%)R值正常对照组—101000000．083##模型组—10000370．862苦参碱(Matrine)8010044200．453##4010034210．518#2010005320．653阳性对照组(硫普罗宁)3010053200．430##总计—6010121612100．500

注：与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01。

4 讨论

酒精性肝病(ALD)是全球范围内影响人类健康的重要疾病，短时间内大量摄入乙醇可导致肝脏发生严重损伤，即急性酒精性肝损伤[9]。本实验采用50%乙醇灌胃诱发小鼠急性肝损伤模型，该模型与人急性酒精性肝损伤相似[7]。动物体内ALT和AST是肝细胞内主要功能酶，它们广泛存在于肝细胞中，当肝组织损伤及坏死时，肝细胞膜和细胞器结构被破坏，膜流动性失常，酶从细胞释放入血，血清中ALT、AST含量就会升高，故ALT、AST的高低可用来判断其肝损伤的程度[10]。本实验结果表明，苦参碱可使乙醇致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST水平显著降低。说明苦参碱对乙醇致急性肝损伤小鼠肝功能具有一定保护作用。

研究表明，乙醇诱导的急性肝损伤机制与乙醇及其代谢产物引起的氧化应激密切相关，被认为是最重要的发病机制之一[5,6,11]。氧化应激主要是过多氧自由基(ROS)与抗氧化酶系统(SOD和GSH-px等)的不平衡所致。抗氧化酶的活性反映机体对氧自由基清除能力的高低，故可通过提高机体抗氧化酶活性，来减少氧自由基的增多以抑制氧化应激反应。而增多的氧自由基与生物大分子发生脂质过氧化反应，造成生物膜损伤并使产生的过氧化物丙二醛(MDA)的含量升高。MDA是脂质过氧化反应的终产物，其含量高低也能够在一定程度上反映肝脏受损情况[11-12]。肝脏是乙醇代谢的主要场所，饮酒后约90%的乙醇由肝脏的乙醇代谢系统，即乙醇脱氢酶(ethanol dehydrogenase, ADH)和乙醇氧化系统(microsomal ethanol oxidizing system, MEOS)代谢清除。体内乙醇大部分由ADH代谢转化为乙醛，再由乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)催化生成无毒的乙酸，最终进入三羧酸循环生成能量、CO2和H2O。而乙醛转化为乙酸的速度较慢，容易蓄积在体内。乙醛可与肝细胞中蛋白、DNA形成加合物影响蛋白质的变构，使酶失活使肝细胞功能受损[13]。同时乙醛也可通过黄嘌呤氧化酶转变为超氧化物和氧自由基，使机体ROS增多，引发氧化应激，导致MDA增高，SOD、GSH-px大量消耗，肝脏清除自由基能力下降[14]。由此可见，氧化应激及脂质过氧化受阻在酒精性肝损伤的过程中意义重大，而维持机体内SOD和GSH-px的活性，就能够清除代谢产生的多量自由基，进而保护肝脏。因此，维持机体氧化-抗氧化系统的动态平衡至关重要。本实验结果表明，模型组与正常组比较，血清ALT、AST活性明显增加，而肝脏组织SOD及GSH-px明显降低，MDA增多。说明急性酒精性肝损伤小鼠模型的建立是成功的。而苦参碱各剂量组和模型组比较，血清ALT、AST活性明显降低，肝脏组织SOD和GSH-px活性增加， MDA含量降低，表明苦参碱可通过提高肝脏组织中SOD及GSH-px活性，降低肝细胞内的ROS，从而稳定细胞膜，降低血清中转氨酶含量，进而减轻肝损伤，保护肝细胞。此外，组织病理学结果也表明苦参碱各组肝小叶及肝细胞病理改变较模型组明显好转，说明苦参碱可减轻乙醇致小鼠急性肝损伤。

综上所述，苦参碱对乙醇致小鼠急性肝损伤具有保护作用，其机制与降低血清ALT、AST和肝脏组织中MDA含量，增加肝脏组织中SOD及GSH-px活性及抗氧化应激有关。

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(责任编辑：宋勇刚)

Protective Effects of Matrine on Acute Ethanol-Induced Liver Injury in Mice

Wu Yang1,2,Wang Yang3, Ma Xueqin1,2

(1.Department of Pharmacology, NingXia Medical University, Ningxia 750004, China;2.Ningxia Engineering & Technology Research Center for Modernization of Hui Medicine, Ningxia 750004, China;3.Yinchuan Stomatology Hosptial, Ningxia 750004 China)

Objective:To investigate the protective effect of matrine on acute ethanol-induced liver injury in mice and its mechanism. Methods:Male Kunming mice were randomLy divided into the control group, model group, positive control group (Tiopronin) and different concentration of matrine (80 mg/kg, 40 mg/kg and 20 mg/kg) and irrigation stomach respectively for 6 days. The mice were induced alcohol acute liver damage by ethanol (50%，5 g/kg) at the last administration beside control group. After 12 hours ethanol treatment, the determination serum aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT); MDA, SOD and GSH-px in liver tissue were detected. Pathological changes in liver tissue were checked by the Ridit analysis method.Results:The determination of liver index, activity of serum AST and ALT and MDA in liver tissue homogenate were significantly reduced(P<0.05)and the activity of SOD and GSH-px in liver tissue were increased(P<0.05) in each dose of matrine. The value of R in matrine high and middle doses were decreased (P<0.05). Conclusion:Matrine has a significant protection against acute ethanol induced hepatic injury, and the mechanism may be associated with anti-oxidative activities.

Matrine; Ethanol; Acute Liver Injury; AST; ALT; Oxidative Stress

2014-07-23

宁夏医科大学科学研究基金资助面上项目(XM200910)

吴洋(1979-)，女，博士，宁夏医科大学讲师，研究方向为细胞分子药理学。E-mail: charming_wuyang@163.com。

R285

A

1673-2197(2014)19-0006-03