文心兰2种主要病毒的快速检测及其组培脱毒方法

刘福秀等

摘 要 利用感染了建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的文心兰叶片，建立同步检测文心兰2种病毒的双重RT-PCR方法，该方法可一次性扩增出2种病毒的DNA条带，最低可检测到相当于1 μg的带毒叶片。同时采用花梗组织培养脱毒并结合培养基添加病毒A的脱毒方法，对感染2种病毒的文心兰进行外植体脱毒试验，获得文心兰组培苗脱毒方法。用建立的双重RT-PCR检测脱毒效果，脱毒率为75.3%。

关键词 建兰花叶病毒（CymMV）；齿兰环斑病毒（ORSV）；RT-PCR；文心兰；脱毒

中图分类号 S682.31 文献标识码 A

Rapid Detection of 2 Main Viruses in Oncidium and the Method

of Virus Elimination by Plant Tissue Culture

LIU Fuxiu， WANG Anshi， HAN Yuchun， LIN Mingguang*

Hainan Entry & Exit Inspection and Quarantine Bureau， Haikou， Hainan 570311， China

Abstract A duplex RT-PCR method was developed for rapid detection of Oncidium infected 2 important virus， Cymbidium mosaic virus（CymMV）and Odontolossum ring spot virus（ORSV）， in one step. It could detect the virus as low as 1 μg leaf tissue. And a method of virus elimination by plant tissue culture was developed. It combined with lateral mud tissue culture and an anti-virus reagent， virus A， and verified the effect of virus-free by duplex RT-PCR. The results showed that the virus-free rates of this lateral bud culture were 75.3%.

Key words Cymbidium mosaic virus； Odontolossum ring spot virus； RT-PCR； Oncidium； Virus elimination

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.025

文心兰（Oncidium）又名跳舞兰、舞女兰、金蝶兰、瘤瓣兰等，系兰科文心兰属植物的总称，属于热带复茎性着生兰，原产于西印度群岛、墨西哥、巴西等地[1-3]。以其花姿优美、花色亮丽抢眼，甚具喜气，在西洋插花或是节庆活动上常被广泛应用。随着市场需求量的增大，文心兰得到大量推广种植，种苗主要通过组培快繁获得。但在生长过程中易受到多种病毒的危害，严重影响其产量和品质，其中以建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）和齿兰环斑病毒（Odontolossum ring spot virus，ORSV）发生最为普遍，且这两种病毒通常在文心兰上复合感染，造成更为严重的危害[4-7]。目前对病毒病害的防治主要采用茎尖组织培养结合热处理技术[1，8-9]，但有关文心兰脱毒处理却少有报道，虽然朱根发等[10]早在1997年就有了关于“文心兰脱毒快繁技术研究”的报道，并且通过ELISA法对脱毒后样品中包括CymMV和ORSV在内的4种病毒进行了检测，但作者研究所使用的材料未经过病毒检测，整个脱毒过程也没有专门的病毒抑制步骤和污染控制方法，只在检测诱导出的文心兰原球茎时均未发现病毒。

为增强我国文心兰产业的国际竞争力，本研究采用不同的脱毒方法，对感染CymMV和ORSV的文心兰种苗进行外植体脱毒试验，探索出文心兰脱毒处理的适宜方法，并获得文心兰完全脱毒苗。

多重PCR方法可以通过1次试验同时检测2种或2种以上的病毒，如Kuroda等[11]建立了可同时检测黄瓜花叶病毒（CMV）、蚕豆萎蔫病毒（BBWV-2）和三叶草黄脉病毒（ClYVV）的多重RT-PCR技术；Ito等[12]建立了可检测柑橘裂皮类病毒（CEVd）等6种病毒的多重RT-PCR技术，Xie等[13]建立了一步法RT-PCR同时检测4种甘蔗病毒的方法。本研究建立了文心兰两种主要病毒的双重RT-PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

带毒和健康供试文心兰均采自海南文昌市热带植物隔离检疫农场的文心兰鲜切花品种圃。DAS-ELISA所用的碱性磷酸酶标记的CymMV和ORSV检测试剂盒，购自ADGEN公司。RNA提取试剂盒和RT-PCR试剂购自大连TaKaRa公司。20%病毒A可湿性粉剂购自安徽淮南山河药业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank公布的CymMV的外壳蛋白（coat protein，CP）基因和ORSV CP 基因的保守序列，分别设计RT-PCR的2对特异性引物，由上海Sangon公司合成。引物信息见表1。

1.2.2 酶联免疫吸附法（DAS-ELISA） 称取100 mg样品叶片，加磷酸缓冲液充分研磨，将研磨所得汁液于3 000 r/min离心5 min，取病汁液上清进行双抗体夹心（DAS-ELISA）检测。以DAS-ELISA和RT-PCR结果均为阳性的样品为阳性样品，均为阴性的样品为阴性样品进行组织培养。

1.2.3 双重RT-PCR方法及特异性试验 将100 mg DAS-ELISA检测CymMV和ORSV均为阳性的样品叶片用液氮研磨后，利用RNA提取试剂盒提取总RNA。以提取的RNA为模板进行反转录。

反转录体系20 μL，10 mmoL/L dNTPs 1 μL、20 μmoL/L CyR引物1.5 μL、20 μmoL/L OR引物1.5 μL、RNA模板1 μL，70 ℃反应5 min，冰上放置5 min，加入AMV酶5倍缓冲液4 μL、200 U/μL AMV RT（反转录酶）1 μL、40 U/μL RNA酶抑制剂1 μL，加DEPC-H2O补足20 μL，单一病毒检测时引物改为2.0 μL，其余不变，42 ℃反应1 h。

PCR反应体系20 μL，上述反转录产物2 μL、10倍PCR缓冲液（含Mg2+） 2 μL、10 mmoL/L dNTPs 0.6 μL、4条引物各0.5 μL、2 U/μL Taq DNA聚合酶1 μL，灭菌ddH2O补足20 μL，单一病毒检测时只加其中一对引物。于PCR仪（Veriti 96 Well Thermal Cycler，Applied Biosystems）上进行扩增，反应程序为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min 20 s，30个循环；72 ℃ 7 min。

扩增结束后取15 μL PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，并用Syngene GBOX CHEMI XR5凝胶成像系统记录结果。

1.2.4 克隆与测序 PCR产物电泳后分别割胶回收，依次克隆到pMD18-T载体（TaKaRa）上，酶切鉴定阳性克隆后，送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。每个产物至少测3个克隆，每个克隆都进行正反向测序。

1.2.5 检测灵敏度的确定 提取得到的植物总RNA最后溶于30 μL DEPC处理ddH2O。将所得植物总RNA按10倍梯度依次稀释，按上述方法进行cDNA合成和PCR扩增，取15 μL进行电泳分析。

1.2.6 脱毒 按照王安石等[14]通过组织培养的方法获得增殖至第3代的组培苗，从继代第4次时开始在培养基中分别添加0、5、10、15 mg/L病毒A，连续添加3代。病毒A使用前经灭菌的0.22 μm细菌过滤器过滤。用DAS-ELISA和RT-PCR检测第6代组培苗的脱毒效果并统计原球茎的诱导与增殖情况。

2 结果与分析

2.1 双重RT-PCR检测

用双重PCR体系分别检测单独感染CymMV、ORSV以及复合感染两种病毒的样品，RT-PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，结果单独感染CymMV的样品获得1条大小约670 bp DNA扩增片段，结果单独感染ORSV的样品获得1条大小约520 bp DNA扩增片段，复合感染两种病毒的样品同时获得670 bp和520 bp两条DNA扩增片段，均与预期结果一致，而健康植株和清水对照都没有扩增片段出现（图1）。克隆测序后在GenBank中BLAST检索，结果675 bp较大片段的序列与GenBank中已发布的CymMV相应序列一致性达95%以上。524 bp较小片段的序列与GenBank中已发布的ORSV相应序列的序列一致性达96%以上。表明扩增的片断分别来自CymMV和ORSV，即该方法能准确检测出这两种病毒。

2.2 灵敏度检测结果

将所得植物总RNA按10倍梯度依次稀释后进行RT-PCR，均能扩增出清晰的条带。CymMV单重RT-PCR检测时稀释106倍后仍能扩增出条带；ORSV单重RT-PCR检测时稀释105倍后仍能扩增出条带，但稀释106倍后扩增不出明显的条带；而双重RT-PCR检测时只能扩增出稀释104倍目的条带，稀释105倍后不能扩增出条带（图2）。因此，可以用本研究方法检测文心兰中的CymMV和ORSV，且检测灵敏度至少能达到105倍，虽比单重RT-PCR检测灵敏度稍低，但比DAS-ELISA检测灵敏度（数据未公布）至少高103倍。

2.3 病毒A对组培苗生长的影响

以健康兰株花梗为外殖体，进行组培扩繁，不同浓度的病毒A对原球茎诱导与增殖的影响见表2。从表2可以看出，病毒A浓度在10 mg/L以下时对原球茎诱导与增殖影响与不添加病毒A时差异不明显，但当病毒A的浓度增加到15 mg/L时，开始出现生长抵制现象。

2.4 病毒A对脱毒效果的影响

在增殖培养基中分别添加0、5、10、15 mg/L病毒A，选取分别携带CymMV、ORSV及两种病毒复合感染的兰株花梗为外植体进行组培脱毒处理，带毒情况用DAS-ELISA和RT-PCR检测，两种结果均为阳性的兰株花梗为阳性样品，以健康兰株花梗为阴性样品。于炼苗结束后移栽前随机抽取96株小苗，同样用DAS-ELISA和RT-PCR检测小苗带病毒率。结果所有阴性样品两种检测方法均未检测到病毒，且使用病毒A处理的脱毒率明显高于不使用病毒A处理。随着病毒A浓度的增高，脱毒率随之升高。病毒A浓度为5 mg/L时，脱毒效果不理想，DAS-ELISA也能检测到病毒，双重RT-PCR检测的脱毒率有时不足50%。但病毒A浓度达到10 mg/L及以上时，所有阳性样品组培苗用DAS-ELISA均未检测到病毒，双重RT-PCR检测的脱毒率均达70%以上，且复合感染样品检测时两种病毒均同时出现。结果见表3。

3 讨论与结论

近年来应用RT-PCR技术建立了多种兰花病毒快速检测方法，并通过不断优化检测程序来提高检测特异性、缩短检测时间、提高检测效率。但是这些方法均是针对单一病毒进行检测。为了降低检测成本、缩短病毒检测时间，周国辉等[15]、郑国华等[16]、曾燕君等[17]先后建立了双重RT-PCR同时检测2种兰花病毒的方法，有效地解决了这一问题，并利用该方法对田间兰花进行了病毒检测。但均没有对检测方法的稳定性和灵敏度进行评估，本研究建立的检测方法在综合前人方法的基础上开发出了一套新的检测引物，实现了更好的扩增，提高了检测稳定性和灵敏度（图1），且检测灵敏度很高，稀释105倍后仍能扩增出条带（图2）。

有关文心兰组织快繁技术的报道很多[10，14，18]，但文心兰脱毒处理方面的研究少有报道。朱根发等[10]报道的在检测诱导出的文心兰原球茎时均未发现病毒的原因可能是所选择的实验材料本身就是不携带病毒的，其研究内容主要是组培技术，少有脱毒技术。病毒病是制约文心兰产业发展的一个重要因素，本研究首次在文心兰脱毒种苗的生产中加入病毒A。组织培养至确定获得无菌苗的第3代组培苗后，从继代第4次时开始在培养基中分别添加0、5、10、15 mg/L病毒A，病毒A使用前经灭菌的0.22 μm细菌过滤器过滤。随着病毒A添加浓度的提高和转接代数的增加，脱毒率不断提高，但组培苗的枯死率也相对的增加（数据未显示），不宜多代添加。本研究连续添加3代。用DAS-ELISA和RT-PCR检测第6代组培苗的脱毒效果并统计原球茎的诱导与增殖情况。结果表明，病毒A浓度达到10 mg/L及以上时，所有阳性样品组培苗用DAS-ELISA均未检测到病毒，双重RT-PCR检测的脱毒率均达70%以上，且复合感染样品检测时两种病毒均同时出现（表3）。但病毒A浓度达到15 mg/L时，增殖生长情况会受到一定程度的抑制（表2），表明高浓度的病毒A不利于文心兰组培苗的增殖。笔者推荐病毒A的使用浓度为10 mg/L，在此基础上结合病毒检测技术，能有效生产出无毒文心兰种苗。

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责任编辑：沈德发