啤酒废水培养螺旋藻的研究啤酒废水培养螺旋藻的研究

柳青 张端 贺亚龙 张景来

摘要[目的]研究啤酒废水培养螺旋藻的可行性。[方法]利用啤酒废水培养螺旋藻，研究不同废水浓度下螺旋藻的生长状况及其对废水中氮、磷、有机质的去除效率，以及在放大培养时螺旋藻的生物量、蛋白质和脂肪含量。[结果]螺旋藻可在啤酒废水中生存，且啤酒废水有缓冲培养液pH增加的作用，能使螺旋藻更长时间处于适宜生存的状态。50%啤酒废水、50%Zarrouk培养液最适宜螺旋藻生长，且产量达到最大。同时，螺旋藻可对啤酒废水产生净化作用。螺旋藻对100%啤酒废水中有机质、总氮、总磷的去除效率分别可达55.95%、77.78%和42.62%。在最佳配比浓度条件下，放大培养的产藻量为0.794 g/L，蛋白质和脂肪含量分别达到69.5%和8.11%。[结论]该研究可使污水净化和螺旋藻利用相结合，达到环境与经济效益的统一。

关键词螺旋藻；啤酒废水；去除率；产藻量

中图分类号X797文献标识码A文章编号0517-6611（2014）01-00054-03

作者简介柳青（1990- ），女，安徽阜阳人，硕士研究生，研究方向：资源经济学，Email：irisliuqing@163.com。

收稿日期20131212近些年，由于工业企业将大量富含高营养物质的工业废水排放到自然水体中，引发了严重的水体富营养化问题，赤潮、水华频发。寻找一种经济有效处理工业废水的方法是当务之急。该试验试图利用能在较高营养物质及严苛的生存条件下生存并对废水进行处理的螺旋藻，使污水净化和利用相结合，达到环境与经济效益的统一。

螺旋藻是目前常用微藻（小球藻、绿藻、螺旋藻）中蛋白质含量最高、营养最全面的藻种，它的蛋白质含量高达60%～70%，是小球藻的1.5倍[1]。螺旋藻生长所需pH高（pH 9～11），一般杂菌难以在其培养液中生长，可采用直接接种进行培养[2]。啤酒废水富含有机物质和氮、磷等成分，其化学需氧量（COD）可达到10 000 mg/L以上，未经处理直接排放会对环境造成严重污染，普通啤酒废水处理的成本又很高。螺旋藻具有培养条件简便、繁殖速度快、对环境适应性强以及高蛋白质高脂肪含量等特点，如果可以大规模利用啤酒废水养殖螺旋藻，将是一个低费用、高效益的处理废水的方法，同时能够为生物质油的制造提供良好原料。笔者利用啤酒厂废水培养螺旋藻，研究了不同废水浓度下螺旋藻的生长状况及其对废水中氮、磷、有机质的去除效率，以及在放大培养时螺旋藻的生物量、蛋白质和脂肪含量。

1材料与方法

1.1试验材料Zarrouk培养基：NaHCO316.80 g/L，NaCl 1.00 g/L，K2HP O40.50 g/L，NaNO3 2.50 g/L，K2SO4 1.00 g/L，MgSO4·7H2O 0.20 g/L，CaCl2·2H2O 0.04 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，Na2EDTA 0.08 g/L[2]。A5溶液：H3BO3 2.86×10-3 g/L，MnCl2·4H2O 1.81×10-3 g/L，ZnSO4·7H2O 0.22×10-3 g/L，CuSO4·5H2O 0.079×10-3 g/L，MoO3 0.015×10-3 g/L。B6溶液：NH4VO3 22.9×10-6 g/L，NiSO4·7H2O 47.8×10-6 g/L，Co（NO3）2·6H2O 4.4×10-6 g/L，NaWO4 17.9×10-6 g/L，TiSO4 40.0×10-6 g/L。

1.2试验方法试验利用过滤（抽滤法）后的啤酒废水和Zarrouk培养液按照不同配比混合培养：①按照啤酒废水含量0%、25%、50%、75%、100%与Zarrouk试剂进行混合，每个浓度设计两个平行样本，总计10个试样；②添加营养元素进行培养：用硝酸盐代替氮元素，而钙离子和镁离子则由自来水直接提供；③用250 ml锥形瓶于恒温箱内培养，光照强度2 000 xl，温度30 ℃，每隔3 h晃动一次，光暗周期为12 h∶12 h。

1.3螺旋藻生物量该试验使用钝顶螺旋藻（Spirulina platensis），购自中国科学院武汉水生生物研究所。采用分光光度法测定螺旋藻生物量。在每天的相同时间利用分光光度计测定各螺旋藻样品在560 nm波长处的吸光度，根据得到的吸光度在标准曲线上找到对应的螺旋藻浓度，以了解螺旋藻的生长情况。比增长速率（R）根据以下公式计算：R=ln（x2/x1）/（t2-t1）。式中， x1为初始时的藻现存量；x2为结束时的藻现存量；t1为测定x1的日期；t2为测定x2的日期。

1.4培养液分析测定项首先，对啤酒废水水质进行分析，主要目的是测定螺旋藻对啤酒废水中以下指标的去除率，因此测定培养液在培养螺旋藻前后的总氮、总磷、COD以及pH的变化情况。培养液pH：利用pH快速测定仪测定5、10、15 d锥形瓶中藻液的pH以了解螺旋藻的生长环境。总磷的测定：采用钼酸铵分光光度法，利用721分光光度计测定5、10、15 d的培养液总磷。总氮的测定：采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定5、10、15 d的培养液总氮。COD的测定：采用快速消解分光光度法，利用COD快速消解仪测定5、10、15 d的培养液COD。

然后，进行扩大培养。由不同浓度配比的混合液中螺旋藻的生长情况得到最佳配比，在大缸中进行相对大规模培养。最后对得到的产物进行分析，通过测定其蛋白质、脂肪含量，了解螺旋藻的生长情况和未来合成生物质油的潜力。由恒温箱培养得到50%啤酒废水和50%Zarrouk培养液的比例下，螺旋藻的生长效果最好。因此以该比例放大培养，采用30 L啤酒废水和30 L Zarrouk培养液进行培养，接种比例为1∶12.5，光照强度2 000 xl，温度30 ℃，光暗周期为12 h∶12 h。在大缸中放置两个恒温加热器和一个循环机以保持微藻的生长均匀。对培养所得的藻体进行处理，称取干重。收集50 ml藻体于筛绢上，于60 ℃烘干至恒重，冷却后称量，计算产藻量。最后进行产物分析，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，利用索氏提取器提取脂肪进行测定。

2结果与分析

2.1恒温箱培养

2.1.1生物量测定。对试验获得的干藻粉进行生物量测定。称取干燥后的藻粉，配制成5 g/L的藻液，利用超声波使干藻粉充分溶解，摇匀。精确吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml藻液于10只比色管中，加蒸馏水至50 ml标线，摇匀。利用721分光光度计在560 nm处测定其吸光度，得到螺旋藻吸光值与藻细胞浓度的标准曲线。

分别配制0%、25%、50%、75%、100%的啤酒废水-Zarrouk培养液，做平行试验，以0A、0B、25A、25B、50A、50B、75A、75B、100A、100B标记（75A表示啤酒废水含量为75%，Zarrouk培养液含量为25%的平行试验1组）。每日测定其吸光度，并在标准曲线图中找出对应的螺旋藻浓度，结果如表1所示。在15 d的培养周期内，螺旋藻浓度呈逐渐增加的趋势。在接种初期，由于接种量较低、光强较强，细胞生长出于迟滞状态。此后，细胞逐渐进入指数生长期，个体数量迅速增加，但在大约13 d后，生长速度变缓，进入了生长的稳定期。

2.1.2培养液性质测定。

2.1.2.1pH。由于pH的测定过程耗时较长，且每天的pH相差不大，整体变化情况比较稳定，所以每5 d测定一次pH，利用pH快速测定仪进行测定。由表2可知，pH呈逐渐上升趋势。因为随着藻细胞浓度的增加，对无机碳的利用也随之加强，pH呈现上升趋势。随着废水浓度的增加，pH升高的趋势变缓。由此可见，添加了啤酒废水对培养液的pH起到缓冲作用，使之升高速度减慢，从而延长了适宜螺旋藻生长的时间。因此在培养液中适当添加废水有助于螺旋藻的生长。

2.1.2.2总磷。利用钼酸铵分光光度法测定总磷。用甲苯做萃取剂，萃取水样中的单质磷。萃取液经溴酸钾-溴化钾溶液将单质磷氧化成正磷酸盐，在酸性条件下，正磷酸盐与钼酸铵反应生成的磷钼杂多酸被还原剂氯化亚锡还原成蓝色络合物，其吸光度与单质磷的含量成正比，用分光光度计测定其吸光度，计算单质磷的含量。按照钼酸铵分光光度法的步骤，绘制得到磷标准曲线。培养液中总磷浓度由0.962 mg/L下降到0.052 mg/L，去除率为42.62%，去除效果较好。

2.1.2.3总氮。采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定总氮。在60 ℃以上水溶液中，过硫酸钾可分解产生硫酸氢钾和原子态氧，而硫酸氢钾在溶液中离解产生氢离子，故在氢氧化钠的碱性介质中可促使分解过程趋于完全。分解出的原子态氧在120～124 ℃条件下可使水样中含氮化合物的氮元素转化为硝酸盐，并且在该过程中有机物同时被氧化分解。可用紫外分光光度法于波长220和275 nm处，分别测出吸光度A220及A275，按下式求出校正吸光度A：A=A220-2A275。按吸光度A值比较标准曲线并计算总氮（以NO3N计）含量。由于啤酒废水原始含氮量较高，超过该方法的量程，故对原水进行了稀释，根据工作曲线得到了相应的浓度数据。在恒温箱培养之前以及培养5、10和15 d测定100%啤酒废水的总氮含量分别为11.7、8.9、5.3和2.6 mg/L。可见，啤酒废水总氮含量较高，达到了11.7 mg/L，而经过螺旋藻的生长和繁殖，废水经过净化，最终的总氮浓度达到了2.6 mg/L，大幅度的减少，去除率达到了77.78%。

2.1.2.4COD。采用重铬酸钾分光光度法测定COD。在一定条件下，经重铬酸钾氧化处理，水样中的溶解性物质和悬浮物所消耗的重铬酸钾相应于氧的质量浓度，1 mol重铬酸钾（1/6 K2Cr2O7 ）相当于 1 mol氧（1/2 O）。试样中加入已知量的重铬酸钾溶液，在强硫酸介质中，以硫酸银作为催化剂，经高温消解后，用分光光度法测定COD值。在进行对COD去除效果的测定工作时，由于使用的是哈希PC MultiDirect分光光度计进行分析读数，校准之后的标准曲线为y=1.395 9 x+11.593 8，R2=0.999 3，拟合度较高，表示替换药品的方法可行。在培养箱培养之前以及培养5、10、15 d测定培养液的COD含量分别为163.9、143.9、105.2和72.2 mg/L。可见整个培养周期，螺旋藻对COD的去除率为55.95%。通过用啤酒废水培养螺旋藻，啤酒废水中的有机物含量大幅下降。

2.2扩大培养

2.2.1产藻量的测定。抽取50 ml螺旋藻液，体积记为V，用500目的双层筛绢进行过滤。过滤前称量筛绢的质量为72.381 9 g，记为m1，过滤之后在60 ℃下烘干筛绢与螺旋藻至恒重，取出待冷却后，称量其质量，为72.421 6 g，记为m2。在50%啤酒废水与50%Zarrouk培养基的条件下，螺旋藻的产藻量达到了0.794 g/L。即使没有添加培养基的纯污水也能培养并收获一定量的螺旋藻。

2.2.2产物分析。

2.2.2.1蛋白质含量。在各个不同配比的标准试样中加入考马斯亮蓝G-250之后，显色2 min以上，利用721分光光度计在595 nm波长处测定其吸光度，将第1组作为空白背景值扣除。根据蛋白质含量不同对应着不同的吸光度值，可以做出蛋白质标准曲线。样品中蛋白质含量的测定：利用500目的筛绢对螺旋藻液进行过滤，用清水反复冲洗至中性，过滤后将筛绢置于60 ℃恒温箱中烘干至恒重。称取0.1 g干藻粉，加入100 ml蒸馏水，在-20和37 ℃反复冻融3～4次。最后一次融化后，以4 000 r/min的转速在离心机里转10 min，取上清液测量其蛋白质含量。最后取0.1 ml的上清液，用蒸馏水稀释至1 ml，加入5 ml G250试剂，显色2 min以上，测其吸光度A=1.378。根据拟合曲线方程，求得测定的0.1 ml上清液中有蛋白质m1=69.5 μg。X=m1/V2×V1/m=69.5/0.1×1/0.1×100%=69.5%。其中，X为干藻粉的蛋白质含量，%；m1为上清液中蛋白质质量，μg；V1为上清液的总体积， ml；V2为提取上清液的体积， ml；m为干藻粉总重量，g。最终得到螺旋藻的蛋白质含量为69.5%，相对较高。这说明利用啤酒废水和Zarrouk培养基联合培养的螺旋藻生长情况良好，蛋白质含量在正常范围之内。

2.2.2.2脂肪含量。将样品预先在乙醚溶剂中浸泡一定时间，使部分油脂在乙醚溶剂中浸出，再采用索氏提取法，以乙醚为溶剂，在60～80 ℃的温度条件下进行脂肪抽提。利用脂肪能溶于有机溶剂的性质，在索氏提取器中将样品用无水乙醚或石油醚等溶剂反复萃取，提取样品中的脂肪后，蒸去溶剂，所得的物质即为脂肪或称粗脂肪。X=（m1-m0）/m×100%=（112.690 1-112.527 9）/2×100%=8.11%。其中，X为样品中粗脂肪的质量分数，%；m1为脂肪和脂肪烧瓶的质量，g；m0为脂肪烧瓶的质量，g；m为样品的质量，g。可见，该次大缸培养得到的螺旋藻的脂肪含量大约为8.11%，属于螺旋藻脂肪含量的正常范围。

3结论

（1）螺旋藻可以在经过一定处理的啤酒废水中生长，即使没有添加任何营养成分也可以成活，能够做到污水全培养。

（2）螺旋藻在50%啤酒废水、50%培养液的条件下培养，比增长速率最大，生长量最高。

（3）啤酒废水起到缓冲培养液pH增加的作用，能使螺旋藻更长时间处于适宜生存的状态。

（4）螺旋藻对啤酒废水的有机物、磷、氮有良好的去除效果，去除效率分别可达55.95%、42.62%、77.78%。