东营地区NDV和IBV分离株遗传分析

陈申秒等

摘 要：对东营地区规模化肉鸡养殖场近两年送检的病死鸡进行分子检测，确定NDV和IBV的发生率很高，针对具有典型特征的NDV和IBV分离株分别进行了F基因和S1基因的测定和分析，确定为肾型传支和基因7型新城疫，通过与流行毒株和疫苗毒株的分析为以后该地区的防疫提供帮助。

关键字：NDV；IBV；进化分析

2012年初至2013年7月，本单位收到东营多个规模化肉鸡场送检的病死肉鸡近1000例，经剖检、分子生物学检测﹑分离鉴定及测序分析，确诊为肾性传支IBV和基因7型NDV病毒的流行。将具有代表性的IBV分离株命名为DY717-IBV；NDV分离株命名为DY717-NDV，从分子学上对其进行了遗传分析，希望为该地区传染性支气管炎和鸡新城疫的防治提供帮助。

1 剖检病变

肾脏肿大，尿酸盐大量沉积，“花斑肾”十分典型，沿肾脏出现明显的尿酸盐沉积线，干酪物，气管出血和支气管出血（图1、2、3）。

2 分子生物学检测诊断

3 分离毒株DY717-IBV、DY717-NDV测序分析结果

将分离得到的DY717-IBV、DY717-NDV经分子生物学方法分别对IBV的S基因进行基因克隆，送至北京华大基因测序公司进行测序，将获得的测序结果进行了比对分析。

3.1 DY717-IBV的S基因分析

DY717-IBV与本实验室自行分离的IBV野毒株及保存的相关疫苗毒株，经RT-PCR扩增其S1基因，测序后与传统的经典毒株共同进行基因和推导的氨基酸序列系统发育进化分析，其中H120，IBV-H52株，W491株，W93株均为疫苗毒株；LC株，IBX株，SC0901株（四川），zhejianghuzhou8株（浙江），Taiwan株（台湾），SD10株，RZ株（日照）CAL99-07株，LNX株均为近些年国内流行毒株。DY717-IBV为东营分离株；以上毒株的S1基因序列均被本实验室送往北京华大基因测序结果。

由图5可知，DY717-IBV分离株与H120株，CH-LNX株，RZ株，浙江株，四川株等国内毒株的核苷酸序列同源性较高，都在96%～98.6%之间。江苏分离株与M41株的同源性为77.8%，与491株的同源性为78.4%。

由图6可知，S基因的裂解氨基酸序列分别为HRRRR、RRFRR、RRLRR；根据S1基因的序列和分子遗传进化分析发现：HRRRR是中国IBV肾型毒株近年新出现的裂解位点。疫苗株M1与491株，CAL99株，台湾株的裂解位点为RRF/LRR；H120株，LNX株，SD10株，浙江株的裂解位点均为HRRRR。东营肉鸡DY717-IBV分离株的裂解位点同样也为HRRRR，DY717-IBV分离株为典型的肾型毒株。

3.2 DY717-NDV的测序分析结果

新城疫是由鸡副黏病毒引起的一种急性，高度接触性传染和致死性的传染病，是严重危害养鸡业发展的重要疫病之一。新城疫病毒囊膜上的融合蛋白基因（F基因）是决定毒力和免疫应答的主要因素，F基因裂解位点区的氨基酸组成是NDV致病力的分子基础。NDV强毒株裂解区域氨基酸序列为112R-R-Q-K/R-R-F117，弱毒株的裂解区域氨基酸序列组成为112G-K/R-Q-G-R-L117。

基因2型参考毒株：LaSota，Clone 30，HB92 V4，XD-Shandong08均来自Genbank中已经证实的基因2型NDV弱毒株；基因7型参考毒株：SD09，SDWF02，SG-Liaoning2009，TianJin08均来自Genbank中已经证实的基因7型NDV强毒株；东营肉鸡分离株：DY717-NDV。

图7中，DY717-NDV与基因7型NDV强毒参考毒株的同源性在96.2%～99.8%之间，同源性较高。DY717-NDV分离株与LaSota，Clone 30，HB92 V4，XD-Shandong08等基因2型NDV弱毒参考毒株的核苷酸同源性在82.1%～82.7%之间，同源性相对较低。DY717毒株与LaSota，Clone 30等的疫苗毒株的同源性分别为82.5%和82.7%，也预示着二者与DY717毒株具有一定程度的交叉保护，免疫LaSota和Clone 30的鸡群不能够完全抵御DY717毒株的攻击。

由图8可知，分离株DY717-NDV和基因7型NDV强毒参考毒株SD09，SDWF02，SG-Liaoning2009，TianJin08等全部位于一个较大的共同的分支之上（图8内上方黑框位置），这表明DY717-NDV为基因7型的毒株，毒力相对较强。

LaSota，Clone 30，HB92 V4，TYQ-Shanxi07，XD-

Shandong08等基因2型NDV弱毒参考毒株共同处于一个进化分支之上（图8内下方黑框位置），与DY717-NDV以及基因7型NDV强毒参考毒株有着明显的区别和界限。

由图9可知，综上所述，DY717-NDV与分离株SD09，SDWF02，SG-Liaoning2009，TianJin08均为基因7型NDV强毒毒株。这也表明当前ND的流行仍以基因7型为主。对不同基因型的NDV毒株进行同源性分析发现，不同基因型之间，其核苷酸同源性较低，这也表明我国当前许多鸡群的免疫效果不佳或仅能部分保护，与NDV的基因7型流行有关。

4 小结

通过对IBV东营分离株S基因的分析，该地区分离株与国内毒株的核苷酸序列同源性较高，与M41株、491株的同源性相对较低；其S基因的裂解氨基酸序列为近年来新出现的肾型毒株的裂解位点，流行于该地区的毒株多为肾型传支，且与部分疫苗毒株的同源性较低，正确筛选疫苗毒株具有很重要的临床意义。

分离株DY717-NDV和基因7型NDV强毒参考毒株全部位于一个较大的共同的分支之上，确定DY717-NDV为基因7型的毒株，且毒力相对较强。对不同基因型的NDV毒株进行同源性分析发现，不同基因型之间，其核苷酸同源性较低，这也表明我国当前许多鸡群的免疫效果不佳或仅能部分保护，可见基因7型新城疫在鸡群特别是肉鸡群规模化养殖中的危害较大，对此类毒株开展深层次的研究乃至疫苗的研发亟待进行。（编辑：郭远）