深层发酵培养虎奶菇多糖的培养基优化

王利 王峰

摘要[目的]优化深层发酵培养虎奶菇多糖的培养基。[方法]以不同的培养基深层发酵培养虎奶菇菌丝体和多糖，分离胞内和胞外多糖，在单因素试验和正交试验的基础上，考察碳源、氮源和金属离子对虎奶菇生长及虎奶菇多糖含量的影响。[结果]葡萄糖是最佳碳源，有利于细胞生长和胞内外多糖等代谢产物的积累，从而获得高的多糖产率；酵母膏是最适氮源，可以获得最高的菌丝体生物量和胞外多糖产量；金属离子对细胞生长有影响，在EDTA离子培养基里细胞生长及代谢产物累积效果最佳。在最优培养基培养条件下，总多糖含量为3.34 g/L，胞内多糖含量为1.92 g/L，胞外多糖含量为80.34 mg/g，多糖产率为8.13%，细胞干重为23.62 g/L。[结论]该方法优化了深层发酵培养虎奶菇多糖的培养基，为虎奶菇的种植栽培提供了科学依据。

关键词虎奶菇（Pleurotus tuberregium）；深层发酵；多糖；培养基

中图分类号S646文献标识码A文章编号0517-6611（2014）01-00067-03

基金项目宁夏医科大学青年基金资助项目（XQ200913）；宁夏医科大学教改课题（41）。

作者简介王利（1975- ），女，宁夏银川人，硕士，从事教学和科研工作，Email：wllyhai@ sina.com。*并列第一作者，王峰（1972-），男，宁夏银川人，副主任医师，Email：761855602@qq.com。

收稿日期20131210虎奶菇（Pleurotus tuberregium），又名核耳菇、菌核侧耳、茯苓侧耳、虎奶菌、南洋获苓，属担子菌亚门层菌纲伞菌目侧耳科（Pleurotaceae）侧耳属（Pleurotus），是一种子实体和菌核都可食用的珍稀食用兼药用真菌[1]。鲜菇中含有多种生物活性酶，具有多种生理作用。其中，胰蛋白酶、麦芽糖酶等可以帮助消化；酪氨酸酶有降低血压的作用；多糖化合物则有一定的防癌抗癌作用。菇中所含的脂肪多为不饱和脂肪酸，食用后不会增加血液中的胆固醇含量，可以预防动脉硬化、心脏病及肥胖症等。笔者对虎奶菇的深层发酵进行分析，在菌丝体和发酵液中提取胞内和胞外粗多糖，获取虎奶菇深层发酵产生菌丝体和有效成分，在单因素试验和正交试验的基础上，考察碳源、氮源和金属离子对虎奶菇生长及虎奶菇多糖含量的影响，优化深层发酵培养虎奶菇多糖的培养基，以期为虎奶菇的进一步开发利用提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。虎奶菇（Pleurotus tuberregium），来源于宁夏医科大学公卫实验中心。在MEDOUL培养基上活化菌株，4 d后于36 ℃温育，-4 ℃保存。

1.1.2主要仪器。DIC发酵控制箱，购自上海扬诺锅炉制造有限公司；HYGⅢ回转式恒温摇瓶组件，购自上海彦承实业有限公司；超净工作台，购自济南杰康净化设备厂；HPS360 生化培养箱，购自斯特仪器设备有限公司；TDP3台式离心机，购自恒丰仪器制造有限公司；YXQLSSOSI 蒸煮器，购自南宁蓝天实验设备有限公司；722分光光度计，购自上海精科分析仪器厂；TGP8C离心机，购自北京百晶生物技术有限公司。

1.1.3主要试剂。所用试剂均为国产分析纯，市售。

1.2方法

1.2.1菌种保藏。（1）基础斜面培养基的制备。蛋白胨23 g/L；麦芽糖，6 g/L；CaCl2，0.06 g/L；葡萄糖，11 g/L；NaCl，0.026 g/L；MgSO4·7H2O，0.23 g/L；KH2PO4，0.4 g；（NH4）2HPO4，0.26 g；FeCl3（1%），1.3 ml；VB1，0.002 mg；琼脂，21 g/L；pH5.4～5.8。（2）马铃薯培养基的制备。马铃薯（去皮）200 g，切成约2 cm2的小块，在烧杯里蒸煮40 min，不断搅拌，双层纱布或者滤纸过滤留用滤液，添入23 g木糖，补足水至1 000 ml，pH自然，于120 ℃灭菌20 min。（3）摇瓶摇床成长。先活化斜面菌种，划线摘取些许菌丝体，在装有100 ml液体培养基的250 ml摇瓶里接种，在30 ℃，220 r/min摇床上培养8 d。

1.2.2发酵培养基的制备。虎奶菇菌丝体及滋生胞内多糖的影响因素有培养基组成、温度和摇床转速等[3]。虎奶菇多糖量受不同碳源、阳离子和氮源影响[3]，经高等真菌培养，某些必需氨基酸，如蛋白胨、酵母膏、（NH4）2SO4，在发酵液中的细胞密度增高。氮源为有机氮源，因为虎奶菇是外生菌根真菌的碳氮，仅仅可以吸收单糖和有机氮，碳源是葡萄糖、木糖和奶粉，氮源是蛋白胨、酵母膏和（NH4）2SO4，选择合适C/N比，设计配方。调节pH不利于多糖形成，不同发酵时间至关重要。

1.2.3正交设计试验。为选择最佳加工工艺条件，经分析可知影响虎奶菇质量的主要因素有碳源、氮源和离子等，试验取3个水平进行正交试验（表1）。各试验组以综合评分判定试验结果。

1.2.4虎奶菇菌丝体深层发酵培养。于28 ℃，180 r/min摇床培养8 d后，从摇床拿出三角瓶，将发酵全液在3 000 r/min离心20 min，逐次收集上清液和菌丝体（菌丝体用蒸馏水冲洗并置于-18 ℃冰箱保存）。

1.2.5测定菌丝体生物量、胞内多糖含量的测定与胞内多糖产量的计算。（1）各菌种生长曲线的测定。分别将各虎奶菇酵母菌以3%接种量接种到MRS、YEPD培养基中，每3 h取样1次，测定OD600 nm值。（2）接种扩培，离心收集菌体。根据文献方法[1-3]，将各菌种在相应的培养基中活化培养，收集对数期后期菌体，于6 000 r/min离心25 min，用生理盐水洗涤2次，备用。（3）菌悬液制备。根据文献方法[1-3]，虎奶菇酵母菌选择不同的单一保护剂，分别配制成相应浓度，灭菌（维生素C、L半胱氨酸过滤除菌，其余成分于120 ℃灭菌20 min），在收集的菌泥中加入上述各种单一保护剂[1-3]（菌泥、保护剂体积比为1∶3），再注入冻干管中，同时测定冻干前活菌数。

用标准曲线的回归方程求出Css（μg/ml），采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，发酵液多糖含量=Css×稀释因子/1 000（mg/ml）。计算表达式如下：菌丝体多糖产量（mg/ml）=胞内多糖含量×生物量/培养液量；菌丝体多糖含量=Csm×稀释因子×（提取液体积/菌丝质量）/1 000。采用SAS 拟合葡萄糖含量与吸光度的线性回归，由LSD法计算出DM、EPS、RS和TPS。

2结果与分析

2.1不同发酵培养基对虎奶菇菌丝的生物量的影响由表2和表3可知，不同发酵培养基对虎奶菇菌丝的生物量均有明显影响。以葡萄糖、奶粉和木糖为碳源培养的菌丝体多糖产率之间有显著差异（P≤0.05）；综合结果可知，最佳碳源为葡萄糖。以酵母膏、（NH4）2SO4和蛋白胨三者为氮源培养的菌丝体的多糖产率之间有显著差异；综合结果可知，最佳氮源为酵母膏。金属离子对菌丝生物量也有显著影响，EDTA、氯化铁之间无差异性，但与氯化钙均有显著差异。

2.2不同发酵培养基对胞外多糖的影响由表2和表4可知，不同发酵培养基对胞外多糖均有明显影响。以葡萄糖、奶粉和木糖为碳源培养的菌丝体胞外多糖含量均有极显著差异（P≤0.01）；综合结果可知，以葡萄糖为碳源培养的胞外多糖产率最高。氮源酵母膏、（NH4）2SO4培养的胞外多糖含量与蛋白胨之间有显著差异；综合结果可知，酵母膏是最佳氮源。金属离子EDTA培养的胞外多糖含量与铁离子、钙离子之间也有差异性。

2.3不同发酵培养基对胞内多糖的影响由表2和表4可知，不同发酵培养基的胞内多糖含量有明显影响。葡萄糖与奶粉、木糖二者之间的胞内多糖有极显著差异（P<0.01），葡萄糖做碳源的胞内多糖值较高；氮源（NH4）2SO4、蛋白胨二者与酵母膏的胞外多糖有显著差异（P<0.05），（NH4）2SO4是优化氮源，能产生较高胞内多糖的菌丝体；金属离子则对胞内多糖积累，无显著性影响（P>0.05）。

2.4不同发酵培养基对总多糖的影响由表2和表6可知，不同发酵培养基对总多糖含量有明显影响。葡萄糖、奶

2.5pH的考察由表2和表7可知，发酵过程中pH值有所下降。不同组成发酵培养基对最终pH值均有明显影响。以葡萄糖、奶粉、木糖为碳源的培养基最终pH值无显著差异（P>0.05）。酵母膏、（NH4）2SO4与蛋白胨之间的最终pH值表现出显著差异（P<0.05）；EDTA、金属离子铁、钙之间的最终pH值差异不显著（P>0.05）。

2.6发酵残糖率（RS）分析值的估量比较由表2和表8可知，发酵培养基组分对虎奶菇的发酵残糖率（RS）有明显影响。以葡萄糖、奶粉和木糖为碳源的培养基对发酵残糖率有极显著影响（P<0.01）；以葡萄糖的生物利用率高，但相对奶粉、木糖有较低的残留。酵母膏、（NH4）2SO4、蛋白胨培养的发酵残糖率之间无显著差异（P>0.05）。EDTA、铁、钙离子之间的发酵残糖率无显著差异（P>0.05）。

2.7多糖产率（TPS）均值估计比较由表2和表9可知，不同发酵培养基对虎奶菇多糖产率有明显影响。以葡萄糖为碳源培养的生物代谢产物累积率最高；以酵母膏为氮源培养的多糖产率与蛋白胨、（NH4）2SO4有显著差异（P<0.05）；EDTA、铁和钙离子对多糖产率无显著影响（P>0.05）。

3结论与讨论

虎奶菇主要的成分为多糖体，如虎奶菇中的虎奶多糖（lentinan），这些具高分子量的多糖有强的抗癌作用[4-5]。其中，有关虎奶菇多糖抗肿瘤的研究较多。试验结果发现，高分子多糖体主要是依据增强体内细胞的防卫能力而达到防癌的功能。在最优化培养基的条件下发酵，总多糖含量达3.34 g/L，胞内多糖含量达1.92 g/L，胞外多糖含量达80.34 mg/g，多糖产率为8.13%，细胞干重为23.62 g/L。